Vsebina

OFS.1.7.2.0022.15 Ugotavljanje pristnosti in čistosti imunobioloških zdravil z Western blotom

SPLOŠNO FARMAKOPEJSKO DOVOLJENJE

Predstavljeno prvič

Ta splošna farmakopejska monografija zajema metodo Western blot, eno od metod imunoblota, ki se uporablja za ocenjevanje pristnosti in čistosti imunobioloških zdravil (ILP), ki temeljijo na visoko prečiščenih beljakovinah, vključno s tistimi, pridobljenimi s tehnologijo rekombinantne DNK.

Prvi korak je elektroforeza v poliakrilamidnem gelu z natrijevim dodecil sulfatom (ti SDS-PAGE elektroforeza) za ločevanje proteinov. Proteini se nato prenesejo na nitrocelulozno membrano ali PVDF membrano (poliviniliden fluoridna membrana). Detekcija poteka s protitelesi, specifičnimi za beljakovino, ki jo določamo, konjugiranim z alkalno fosfatazo ali hrenovo peroksidazo (direktni ELISA), ali zaporedno z uporabo prvih protiteles proti beljakovini, ki jo določamo, in drugih protiteles (ti antiglobulinski serum), specifičnih proti imunoglobulinom prvih protiteles, konjugiranih z alkalno fosfatazo ali hrenovo peroksidazo (indirektna ELISA).

Ta GPM opisuje metodo detekcije na podlagi barvne reakcije, ki je trenutno ena najpogosteje uporabljenih. Za detekcijo lahko uporabimo tudi kemiluminiscenčno metodo, tudi tiste z okrepljeno kemiluminiscenco, ter metode radioaktivnih ali fluorescentnih oznak (RIA ali RIF).

Test se izvaja s farmacevtskimi substancami ali končnimi izdelki.

Pri ocenjevanju pristnosti je treba v fazi izvajanja elektroforeze poleg testnih vzorcev v vdolbinice gela dodati še naslednje raztopine: vzorec negativne kontrole (1x pufer za pripravo vzorca), mešanico označevalcev molekulske mase (predhodno obarvana priporočeni označevalci molekulske mase), standardni vzorec testirane beljakovine (če obstaja), certificiran na predpisan način. Pri ocenjevanju čistosti (nečistoče) je treba dodatno poskrbeti za vnos vzorca s koncentracijo beljakovin, ki ustreza meji zaznavnosti ali kvantifikacije nečistoče (odvisno od namena metode) in določeno na podlagi rezultate validacije metode. Pri ocenjevanju čistosti je treba rezultate blota primerjati z rezultati elektroforeze v poliakrilamidnem gelu; tehnika bi morala zaznati 1 % nečistoč.

Metodologija

Za ločevanje beljakovin glede na njihovo molekulsko maso se predhodno izvede elektroforeza v skladu s postopkom, opisanim v Splošni farmakopejski monografiji "Elektroforeza v poliakrilamidnih gelih".

Za prenos beljakovin se uporablja naprava za prenos beljakovin. Vsa dela se izvajajo z gumijastimi rokavicami. Volumen vseh uporabljenih raztopin mora zadostovati za popolno potopitev membrane, na katero se prenesejo proteini.

Po elektroforezi za pripravo gela za imunobloting ga napolnimo s pufersko raztopino za prenos proteinov (razen če ni drugače navedeno v monografiji ali regulativni dokumentaciji), postavimo na orbitalni stresalnik in inkubiramo 10-15 minut. Nato se pripravi plast nitrocelulozne ali PVDF membrane, ki ustreza velikosti gela. Pri uporabi nitrocelulozne membrane se plošča inkubira 5 minut v deionizirani vodi in nato 5 minut v raztopini pufra za prenos proteinov (razen če je v monografiji ali normativni dokumentaciji navedeno drugače). Pri uporabi PVDF membrane jo je treba hraniti v raztopini metanola ali alkohola 10-15 minut, nato pa izvesti enake korake kot pri nitrocelulozni membrani.

Za prenos beljakovin na nitrocelulozno ali PVDF membrano se sestavi "sendvič". V ta namen posebno gobo, ki je priložena instrumentu za prenos beljakovin, namočimo v pufer za prenos beljakovin in položimo na poseben plastični okvir, na katerega položimo enega do tri liste filtrirnega papirja (npr. Whatman 3MM), predhodno narezanega glede na membrano. velikost in beljakovine, namočene v raztopini za prenos. Na vrh se nanese gel, na površino katerega se previdno (brez zračnih mehurčkov) položi pripravljena plast nitrocelulozne ali PVDF membrane. Eno do tri liste filtrirnega papirja, predhodno namočenega v raztopino za prenos proteinov, položimo na membrano in pokrijemo z drugo posebno gobico, namočeno v raztopino za prenos proteinov. Okvir se stisne skupaj in počasi potopi v napravo za elektroforezo, napolnjeno z raztopino za prenos beljakovin, membranski list pa je obrnjen proti anodi. Vklopite napravo. Elektroforetski prenos proteinov se izvaja pri sobni temperaturi 25 minut, pri čemer je tokovna meja nastavljena na hitrost A max = 2 mA / cm 2 (na primer za gel 10 × 10 cm 2 A max = 200 mA), razen če ni drugače navedeno v farmakopejskem članku ali normativni dokumentaciji.

Dovoljena je uporaba opreme za polsuhi prenos proteinov iz gela na membrano v skladu z navodili za njeno uporabo.

Na koncu prenosa se "sendvič" razstavi. Membrana se spere s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS).

Popolnost prenosa beljakovin se oceni vizualno s prenosom barvnih označevalcev molekulskih mas, katerih vse glavne beljakovinske pasove je treba zaznati na membrani.

odkrivanje

Za odkrivanje rezultatov Western blot metode se testni pripravek obdela (hibridizira) s protitelesi. Da bi to naredili, se membrana z beljakovinami, prenesenimi nanjo, postavi v posodo z raztopino blokirnega pufra in inkubira na orbitalnem stresalniku 30–60 minut (razen če ni drugače določeno v monografiji ali regulativni dokumentaciji), da se prepreči nespecifična sorpcija protiteles na membrana.

Po tem se membrana spere v puferski raztopini za pranje trikrat po 5 minut, razen če je v monografiji ali normativni dokumentaciji navedeno drugače.

Nato membrano obdelamo z raztopino prvih protiteles proti analiziranemu proteinu, ki jo pripravimo s pufersko raztopino za protitelesa (če ni drugače navedeno v monografiji ali regulativni dokumentaciji) neposredno pred uporabo v skladu z navodili za uporabo. Zdravljenje s protitelesi poteka pri sobni temperaturi 30-60 minut (če v monografiji ali normativni dokumentaciji ni navedeno drugače).

Nato membrano trikrat po 5 minut speremo s pufrsko raztopino, da odstranimo nevezana protitelesa na orbitalnem stresalniku pri sobni temperaturi, razen če je v monografiji ali regulativni dokumentaciji navedeno drugače.

Po izpiranju membrane se izvede obdelava (hibridizacija) z raztopino drugega protitelesa. Kot druga protitelesa se uporabljajo poliklonska protitelesa proti imunoglobulinom živalske vrste, s katerimi so bila pridobljena prva protitelesa. Ta protitelesa so konjugirana z encimom (hrenova peroksidaza ali alkalna fosfataza). Za izvedbo tega koraka se zgoraj opisani postopek ponovi, pri čemer se raztopina prvih protiteles nadomesti z raztopino drugih protiteles. Nato se izvede podobno prvo pranje membrane od nevezanih drugih protiteles.

Razvoj imunoblot vzorca na membrani izvedemo z raztopino substrata tetrametilbenzidina (TMB) za protitelesa, konjugirana s hrenovo peroksidazo, ali z raztopino za razvoj alkalne fosfataze, če uporabljamo protitelesa, konjugirana z alkalno fosfatazo (če ni drugače navedeno v monografijo ali normativno dokumentacijo).

Reakcijo ustavimo s spiranjem madeža z deionizirano vodo. S filtrirnim papirjem odstranite odvečno vodo s površine membrane in posušite na zraku v temnem prostoru.

Vrednotenje rezultatov

Pri ocenjevanju avtentičnosti morajo glavni barvni pasovi na razviti membrani ustrezati glavnim barvnim pasom na elektroforegramu.

Količino analita in vsebnost primesi ter njuno razmerje ovrednotimo denzitometrično.

Kriteriji primernosti sistema

Rezultati Western blot metode se lahko upoštevajo, če:

• označevalci molekulske mase so enakomerno porazdeljeni po celotni dolžini ustreznega gelnega traku;
• madež prikazuje vse glavne pasove, ugotovljene pri barvanju Coomassie gela s svetlo modrim R-250 ali G-250;
• zaznan je vzorec z najmanjšo koncentracijo, določeno v monografiji ali normativni dokumentaciji

Merila sprejemljivosti

• Ujemanje blota testnega vzorca z blotom referenčnega vzorca, na primer ustreznega standardnega vzorca na osnovi prečiščene beljakovine (snovi);
• skladnost molekulske mase glavne identificirane komponente z zahtevami specifikacije;
• skladnost vsebnosti ugotovljene nečistoče v standardnem vzorcu z razponom, določenim v potrdilu za standardni vzorec.

Uporabiti je treba metodo Western blot za identifikacijo in čistost z validirano učinkovitostjo v smislu specifičnosti in meje zaznavnosti nečistoče.

Značilnosti validacije metode

Pri uporabi metodologije za ocenjevanje avtentičnosti je potrebno utemeljiti kriterije sprejemljivosti rezultatov; priporočljivo je uporabiti standardni vzorec na osnovi prečiščenih beljakovin, certificiran na predpisan način.

Pri uporabi tehnike za ocenjevanje čistosti je treba utemeljiti mejo zaznavnosti nečistoče. Pri kvantificiranju je treba utemeljiti mejo kvantitativnega določanja primesi, navesti linearni razpon pri določanju glavne komponente in primesi, natančnost in pravilnost tehnike. Za to je priporočljivo uporabiti standardni vzorec na osnovi prečiščenih beljakovin. Pri spremembah metode, navedene v monografiji ali normativni dokumentaciji, je treba potrditi validacijske značilnosti predhodno potrjene metode. Naslednje spremembe so predmet potrditve:

• uporaba različnega števila vzorcev, nanesenih na gel;
• spreminjanje pogojev za prenos proteinov iz gela na membrano, vključno s spremembo uporabljene opreme;
• spremembe v sestavi puferskih raztopin;
• sprememba metode odkrivanja preskusne snovi.

Opombe.

1. Pufer za prenos beljakovin pH 8,3.Če v monografiji ali normativni dokumentaciji ni navedeno drugače, se uporabi eden od spodaj opisanih načinov priprave raztopin (glej možnost 1 in možnost 2). Raztopino za prenos lahko uporabimo 2-3 krat. Raztopino hranimo 6 mesecev pri temperaturi od 4 do 8 0 C.

Možnost 1. V graduirano čašo s prostornino 3000 ml damo 7,86 g tris(hidroksimetil)aminometana, 33,75 g glicina, dodamo do 2400,0 ml deionizirane vode in mešamo na magnetnem mešalu do popolnega raztapljanja. Izmeri se pH, ki mora biti enak 8,3 - 8,4 (nastavljanje pH raztopine s kislino ali alkalijo ni dovoljeno). Dodamo 600,0 ml alkohola in premešamo.

Možnost 2. 5,8 g tris(hidroksimetil)aminometana, 2,9 g glicina, 11,55 ml 10 % raztopine natrijevega dodecil sulfata damo v graduirano čašo s prostornino 1000 ml, dodamo 800,0 ml deionizirane vode in mešamo na magnetnem mešalu do popolno raztapljanje, izmerimo pH (8,3-8,4). Dodamo 200,0 ml 100 % metanola in premešamo. Če se uporablja membrana PVDF, se natrijev dodecil sulfat izključi iz puferske raztopine in količina alkohola se zmanjša na 100,0 ml, s čimer se poveča prostornina dodane vode na 900,0 ml.

1. Fosfatno-fiziološka pufrska raztopina (PBS), pH 7,2(če v monografiji ali normativni dokumentaciji ni drugih navedb). 4500,0 ml deionizirane vode vlijemo v merilno posodo in zaporedno dodamo: 40,0 g natrijevega klorida, 1,0 g kalijevega klorida, 5,75 g natrijevega fosfata disubstituirane 2-vode, 1,0 g kalijevega fosfata monosubstituiranega (vsako naslednjo sol dodamo po popolna razpustitev prejšnjega). pH naravnamo na 7,2 z raztopino 70 % fosforne kisline ali raztopino 45 % natrijevega hidroksida. Volumen naravnamo na 5000,0 ml z deionizirano vodo. Raztopino filtriramo in hranimo 3 mesece pri temperaturi 4-8 0 C.
2. Pralni pufer. V merilno bučko prostornine 1000 ml dodamo 5,0 ml 10% raztopine tween-20, dovedemo volumen raztopine do oznake s PBS in premešamo. Raztopino hranimo 1 mesec pri temperaturi od 4 °C do 8 °C.
3. raztopina pufra za blokiranje. V 100,0 ml pralnega pufra dodamo 5,0 mg govejega serumskega albumina (ali druge beljakovine), razen če ni drugače navedeno v monografiji ali normativni dokumentaciji, in mešamo, dokler se popolnoma ne raztopi. Raztopino pripravimo pred uporabo.
4. Puferska raztopina za protitelesa. V 100,0 ml pufra za izpiranje dodamo 2,0 mg govejega serumskega albumina (ali drugih proteinov), razen če ni drugače navedeno v monografiji ali normativni dokumentaciji, in mešamo, dokler se popolnoma ne raztopi. Raztopino pripravimo pred uporabo.

1. Rešitev TMB- raztopina za manifestacijo peroksidaze hrena. Uporabite TMB-substrat, pripravljen za uporabo.
2. Raztopina za manifestacijo alkalne fosfataze. 1 tableto substrata BCIP/NBT raztopite v 10,0 ml deionizirane vode. Raztopino pripravimo neposredno pred uporabo.

Ko so DNK, RNK ali proteini ločeni, jih je treba prenesti na trdno podlago za odkrivanje in druge operacije, ki so v gelu težavne. Postopek prenosa, ki vodi do imobilizacijo molekul , tj. fiksacija v stacionarnem stanju se imenuje blotiranje (v angleščini. - blotiranje ). Kot substrat se uporabljajo najlonske ali nitrocelulozne membrane.

Piskanje(iz angleškega blotting - blotting) je metoda prenosa elektroforetskih fragmentov DNA na poseben film (membrano) iz nitroceluloze, ki veže (imobilizira) enoverižne molekule DNA.

Southern blotting(po imenu avtorja, ki ga je predlagal) temelji na gibanju fragmentov DNA zaradi kapilarnega učinka. Postopek prenosa fragmentov DNK v agaroznem gelu na nitrocelulozni film s filtrirnim papirjem je podoben blotiranju.

Analiza se izvede na naslednji način:

– Izolirana, prečiščena, denaturirana in fragmentirana DNK se postavi na ploščo z agaroznim gelom, kjer se fragmenti elektroforetično ločijo po masi in naboju.

– List agaroznega gela se položi na filtrirni papir, navlažen s koncentrirano fiziološko (pufersko) raztopino.

- Nato se na gel nanese nitrocelulozni filter, kjer pride do imobilizacije (ali adsorpcije ali fiksacije) fragmentov enoverižne DNA.

- Čez filter se položi kup listov suhega filtrirnega papirja, ki zagotavlja počasen pretok puferske raztopine skozi gel (tj. služi kot nekakšna kapilarna črpalka). Fiziološka raztopina, ki gre skozi agarozni gel, nosi s seboj fragmente DNK, ki jih zadrži nitroceluloza in se vežejo nanjo, raztopino pa absorbira suh filter papir.

– Nato se DNA denaturira z alkalijami, filter pa se hrani v vakuumu pri temperaturi 80 0 C, zaradi česar se fragmenti enoverižne DNA ireverzibilno imobilizirajo (fiksirajo) na nitrocelulozi. V tem primeru razporeditev imobiliziranih pasov DNA natančno ustreza njihovi lokaciji v gelu.

– DNA, vezana na filter, se postavi v raztopino z označeno DNA sondo, v kateri pride do hibridizacije. Samo njej komplementarni fragmenti DNK se bodo hibridizirali (tvorili vodikove vezi) s specifično sondo, ki jo je mogoče zaznati kot svetlobne trakove na rentgenskem filmu, tj. avtogram nitroceluloznega filtra

pikanje s pikami. Za pripravo pikčastih madežev se pripravek DNK ali RNK nanese neposredno na filter. Kapljice zdravila izgledajo kot pike na filtru, kar pojasnjuje ime vrste blottinga (angleška pika - pika). 1) Fragmenti dolžine 5–10 baznih parov so oblikovani iz genomske DNA, predhodno obdelane z ultrazvokom.

2) Da so sonde DNA ali RNA na voljo sondi, morajo biti denaturirane, tj. pretvorjen v enoverižno obliko. To se zgodi pod vplivom temperature 100 ° C.

3) Denaturirane nukleinske kisline inkubiramo na ledu: hitro znižanje temperature prepreči njihovo renaturacijo, tj. komplementarno združevanje verig. Denaturirana DNK ali RNK se nanese neposredno na filter, ki se inkubira v raztopini, ki vsebuje sondo.

4) Da analizirana nukleinska kislina ne preide v raztopino, jo je treba pritrditi na filter (membrano). Za to se uporabljata dve vrsti filtrov: nitrocelulozni in najlonski.

Za imobilizacijo nukleinskih kislin na nitroceluloznem filtru uporabimo cvrtje pri 80 °C v vakuumu, na najlonskem filtru pa UV obsevanje 3–5 minut.

5) Po inkubaciji pripravka nukleinske kisline z izotopsko označeno sondo se izvede avtoradiografija v posebni kaseti ali identifikacija z neradioaktivnimi metodami.

Dot blotting vam omogoča odgovor samo na eno vprašanje: ali je v danem vzorcu želeno nukleotidno zaporedje.

Northern blot analiza velja:

1) za izolacijo in analizo RNA (na primer ugotoviti, ali je mRNA, prebrana iz danega gena, prisotna v dani vrsti celice, tj. ali je gen izražen ali ne;

2) določiti količino te RNA in njene spremembe v razvoju danega tipa celice;

3) za določitev velikosti prepisa nekega gena.

V tem primeru se molekule RNA, izolirane iz celice, ločijo po velikosti z gelsko elektroforezo in nato prenesejo v filter. Po hibridizaciji z označeno enoverižno sondo se identificirajo mesta hibridizacije (homologije) RNA in sonde.

Če nukleotidno zaporedje želenega gena (ali mRNA) ni znano, vendar je znan protein, katerega sintezo nadzira, je mogoče izolirati majhno količino čistega proteina, določiti aminokislinsko zaporedje nekaterih njegovih delov ( zadostuje poznavanje 5–6 aminokislinskih ostankov). S pomočjo tabele genetske kode je mogoče ugotoviti vsa možna nukleotidna zaporedja v tistem delu mRNK (ali gena samega), ki kodira določeno aminokislinsko zaporedje. V tem primeru je mogoče sintetizirati sondo za iskanje želenih klonov v genski knjižnici.

Western blottinG(imunoelectroblotting, protein blotting) je metoda za identifikacijo edinstvenih proteinov. Temelji na pojavu visoko specifične interakcije antigen-protitelo. Tako je antigen (tarča) beljakovina, ki jo določamo, sonda pa protitelo proti njej.

Protitelesa proti preučevanemu proteinu se pridobivajo na različne načine. Najenostavnejši je vnos prečiščenega vzorca beljakovin v krvni obtok laboratorijske živali (običajno zajca). V njegovem telesu nastajajo protitelesa (imunoglobulini) na to tujo beljakovino. To so primarna protitelesa, ki bodo delovala s ciljno beljakovino.

Nesmiselno pa je, da bi oznako za identifikacijo vnesli neposredno v ta protitelesa. Za odkrivanje različnih proteinov bi bilo potrebno označiti različna protitelesa, kar bi povzročilo njihovo visoko ceno. Izkazalo se je, da je bolj smiselno uporabljati univerzalna protitelesa – konjugirani antiimunoglobulini, ki so pravzaprav protitelesa proti protitelesom, proizvedenim z uporabo prepoznavne beljakovine kot antigena. Na primer, konjugirani antiimunoglobulini na kunčji Ig bodo medsebojno delovali z vsemi imunoglobulini, sintetiziranimi v kuncu za različne antigene. Tako so ta univerzalna sekundarna protitelesa tista, ki nosijo izotopsko ali neradioaktivno oznako. Poleg neizotopske oznake, ki med številnimi reakcijami povzroči nastanek netopne obarvane spojine (kot v primeru blotiranja nukleinske kisline), se zelo pogosto uporablja kemiluminiscentna oznaka z večjo občutljivostjo.

1) Ekstrakcija proteinov iz homogenata

2) Ločevanje proteinov po molekulski masi z uporabo SDS-elektroforeze v poliakrilamidnem gelu (PAAG). Metoda SDS elektroforeze vključuje denaturacijo nativnih proteinov. Tako bodo beljakovinske molekule z enako molekulsko maso šle skozi isto pot v gelu in se poravnale v obliki traku. Ker so v zmesi beljakovinske molekule različnih velikosti, nastane veliko trakov. Rezultate elektroforeze lahko vizualiziramo z obarvanjem beljakovin (Coomassie briljantno modro, amido črno, srebrno barvanje). Barvanje s srebrom ima edinstveno občutljivost, ki vam omogoča, da zaznate le 0,1 ng beljakovin v nastalem pasu. To je zelo pomembno za nadzor količine beljakovin, ki se nanesejo na gel.

3) Prenos proteinov iz gela na membrano. To se naredi zato, ker poliakrilamid ne dovoljuje velikim molekulam imunoglobulina, da difundirajo na beljakovino. In beljakovina, imobilizirana na membrani, postane na voljo protitelesom. V nasprotju z blotingom nukleinske kisline poteka prenos proteina na membrano pod vplivom električnih sil, tj. v električnem polju.

4) Nastali blot se inkubira s proteinskim antiserumom in nato z antiimunoglobulini. Rezultat je upodobljen glede na uporabljeno vrsto oznake.

Omejitve:

1) velika velikost proučevanih fragmentov, ki znatno presega dolžino sond DNA in preprečuje neposredno molekularno analizo;

2) nezmožnost poljubne izbire koncev proučevanih zaporedij, ki jih določa prisotnost ustreznih restrikcijskih mest v izvirni molekuli DNA;

3) potreba po veliki količini dobro prečiščene visokomolekularne genomske DNA (vsaj 10 μg na reakcijo, kar je enako 0,5-1 ml krvi),

4) za genomsko hibridizacijo - prisotnost radioaktivnih DNK sond z visoko specifično aktivnostjo najmanj 109 impulzov / min * μg), ki delujejo omejeno časovno obdobje, in posebej opremljena izotopska enota. Poleg tega dolga izpostavljenost avtogramov bistveno podaljša čas za pridobitev rezultatov.

5) visoka delovna intenzivnost raziskovanje

Kaj je Western blotting?

Identifikacija proteinov v kompleksnih mešanicah ali izvlečkih različnih tkiv je eden od pogostih problemov. Z uporabo takšnega orodja, kot so specifična protitelesa, je mogoče določiti beljakovino, ki se proučuje, z minimalnimi časovnimi in finančnimi stroški.

Pri Western blotting metodi se na prvi stopnji mešanica proteinov loči z elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata (SDS), nato pa se z elektroblotom prenese na nitrocelulozno membrano. Bistvo te metode je v tem, da se gel po elektroforezi namesti na nitrocelulozno membrano med plasti filtrirnega papirja. Tako sestavljen »sendvič« postavimo v električno polje, da se kompleksi protein-SDS premikajo po gelski plošči in se imobilizirajo (zaradi nespecifične sorpcije) na površini nitrocelulozne membrane.

Pri vezavi kompleksa protein-SDS na nitrocelulozno membrano sodelujejo predvsem električne sile, ta interakcija pa je večtočkovna in vodi do »širjenja« proteinov po površini membrane. Tako po elektrotransferju dobimo repliko gela na nitrocelulozi z enako razporejenimi proteini kot v poliakrilamidnem gelu.

Po SDS - elektroforezi, elektrotransferu in sorpciji proteinov iz gela na nitrocelulozno membrano se terciarna konformacija proteina močno spremeni, če je na splošno pravilno govoriti o obstoju terciarne strukture proteina po tako ostri obdelavi. . Zato se za imunokemično detekcijo proučevanega proteina običajno uporabljajo samo mono- ali poliklonska protitelesa, specifična za linearne regije proteinske molekule. Protitelesa, specifična za konformacijske epitope (ali mesta, ki vključujejo stike med podenotami), na splošno niso primerna za uporabo v Western blot metodi.

Po prenosu proteina se membrana zaporedno inkubira s protitelesi, specifičnimi za proučevani protein, in nato s sekundarnimi protitelesi, specifičnimi za Fc fragmente primarnih protiteles, konjugiranih z encimsko (ali kakšno drugo) oznako (slika 1 A). V primeru, da so primarna protitelesa, specifična za proučevani antigen, neposredno konjugirana z oznako, sekundarna protitelesa niso potrebna (slika 1 B). Imunski kompleksi, ki nastanejo na mestu proučevane lokalizacije proteina, se "manifestirajo" s pomočjo kromogenega substrata (odvisno od vrste oznake).

Občutljivost in specifičnost metode je močno odvisna od tega, katera protitelesa se uporabljajo v študiji. Uporabljena protitelesa morajo biti specifična za edinstveno aminokislinsko zaporedje, ki je specifično samo za proučevano beljakovino. V nasprotnem primeru je možna interakcija (predvsem v primeru grobih proteinskih izvlečkov) protiteles z več proteinskimi molekulami, kar bo posledično povzročilo pojav več barvnih trakov na membrani. Identifikacija proučevanega proteina je v tem primeru pogosto težavna ali celo nemogoča.

Drugi pomemben dejavnik, ki ga morate upoštevati pri izbiri protiteles, je afiniteta. Večja ko je afiniteta uporabljenih protiteles, svetlejši in jasnejši so proteinski trakovi, večja je občutljivost metode. Pri uporabi protiteles z visoko afiniteto lahko dosežemo občutljivost 1 ng in celo več.

Za vizualizacijo rezultata interakcije membransko vezanega antigena in protiteles se uporabljajo sekundarna protitelesa, konjugirana s sredstvi, ki lahko pod določenimi pogoji dajo določen signal. Običajno se kot takšno sredstvo uporablja encim (peroksidaza ali fosfataza), katerega reakcijski produkt ima barvo in se obori na membrani v obliki netopne oborine. Pri tej metodi je mogoče uporabiti tudi fluorescentne nalepke.

riž. 1. Shema imunokemijskega obarvanja proučevanega proteina: A - z uporabo sekundarnih protiteles, konjugiranih z encimsko oznako; B - primarno protitelo je neposredno konjugirano z encimsko oznako.

Protokol:

I. Priprava gela in membrane ter elektroprenos beljakovin

Poliakrilamidni gel po elektroforezi smo dali v kopel s pufrom za popivnanje (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicin, 10% etanol). Na del kasete, ki bo obrnjen proti anodi, položite dva lista filtrirnega papirja, izrezana v obliki kasete za vpijanje in navlažena s pufrom za vpijanje. Nato na filtrirni papir položimo nitrocelulozno membrano, predhodno navlaženo z istim pufrom, pri čemer pazimo, da med membrano in papirjem ni zračnih mehurčkov. Po tem je treba gel previdno položiti na membrano, pri čemer moramo biti še posebej pozorni na odsotnost zračnih mehurčkov med gelom in membrano. Sendvič zaključujeta dve plasti navlaženega filtrirnega papirja, ki ju položimo na površino gela (slika 2). Nastali sendvič vpnemo v kaseto in postavimo med elektrode tako, da je membrana obrnjena proti anodi.

riž. 2. Shema elektroprenosa proteinov na membrano.

II. elektrotransfer

Elektroprenos proteinov na nitrocelulozno membrano poteka v pufru, ki vsebuje 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicin, 10% etanol 30–50 minut pri konstantni napetosti 100 V. Čas elektroprenosa je odvisen od velikosti prenesene beljakovine, večji kot je protein, dlje traja prenos. Kakovost elektrotransporta in razporeditev proteinskih pasov smo ocenili z barvanjem nitrocelulozne membrane z 0,3% Ponceau S v 1% ocetni kislini. Pred imunskim barvanjem je treba membrano večkrat sprati z blago alkalno vodno raztopino Tris, da odstranimo barvilo, vezano na beljakovine.

III. Imunokemijsko obarvanje proteinov, imobiliziranih na nitrocelulozni membrani

Za blokiranje nespecifičnih vezavnih mest za protitelesa se membrana inkubira ob stalnem mešanju pri sobni temperaturi 30 minut v PBST (za boljše blokiranje lahko uporabimo raztopino PBST, ki vsebuje 10 % posnetega mleka v prahu). Po blokadi membrano eno uro inkubiramo pri sobni temperaturi ob stalnem mešanju v PBST, ki vsebuje 1-10 μg/ml specifičnih protiteles. Optimalna koncentracija protiteles je izbrana empirično in je odvisna od afinitete interakcije protiteles z antigenom. Ob koncu inkubacije smo membrano 5-krat sprali s PBST in jo prenesli v raztopino sekundarnih protiteles, konjugiranih s hrenovo peroksidazo. Redčenje konjugata običajno navede proizvajalec na embalaži ali pa jo raziskovalec izbere empirično. Membrano inkubiramo 1 uro v raztopini sekundarnih protiteles ob stalnem mešanju.

Po temeljitem izpiranju (vsaj 5-6 spremembah pufra) se membrana PBST prenese v raztopino kromogenega substrata, ki vsebuje 3 mg diaminobenzidina (DAB) in 10 µl 30 % vodikovega peroksida v 10 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6. . Inkubacijo izvajamo ob mešanju 5 do 10 minut. Po končani inkubaciji s substratom je treba membrano sprati s PBST, posušiti s filtrirnim papirjem in takoj narediti elektronsko kopijo z barvnim skeniranjem. Če se membrana popolnoma posuši, pobarvani proteinski trakovi zbledijo, slika pa je manj svetla in kontrastna.

Opomba: DAB je strupen in potencialno rakotvoren. Delajte samo z gumijastimi rokavicami!

Western blotting uporablja za identifikacijo beljakovin, ki so bile ločene glede na velikost z gelsko elektroforezo. Imunski test uporablja membrano iz nitroceluloze ali PVDF (poliviniliden fluorida). Gel je postavljen poleg membrane in uporaba električnega toka spodbudi proteine, da migrirajo iz gela na membrano. Membrano je nato mogoče nadalje obdelati s specifičnimi protitelesi za tarčo, ki nas zanima, in vizualizirati z uporabo sekundarnih protiteles in detekcijskih reagentov.

Spodaj si oglejte naš videoposnetek protokola Western blot.

​Raztopine in reagenti: lizni pufri

Te pufre lahko shranite pri 4 °C več tednov ali jih razdelite v alikvote in jih shranite pri -20 °C do enega leta.

pufer NP-40

• 150 mM NaCl
• 1,0 % NP-40 (možna zamenjava z 0,1 % Triton X-100)
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• Zaviralci proteaz

pufer RIPA (pufer za radioimunoprecipitacijo)

• 150 mM NaCl
• 1,0 % NP-40 ali 0,1 % Triton X-100
• 0,5% natrijev deoksiholat
• 0,1 % SDS
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• Zaviralci proteaz
  ​

Tris-HCl

• 20 mM Tris-HCl
• Zaviralci proteaz

​Raztopine in reagenti: tekoči, prenosni in blokirni pufri

• 4 % SDS
• 10 % 2-merkaptoetanola
• 20% glikola
• 0,004% bromofenol modro
• 0,125 M Tris-HCl

Preverite pH in ga prilagodite na 6,8
​

Tekaški pufer (Tris-Glycine/SDS)

• 25 mm Trisbase
• 190 mM glicina
• 0,1 % SDS

Prenosni pufer (moker)

• 25 mm Trisbase
• 190 mM glicina
• 20% metanola
• Preverite pH in ga prilagodite na 8,3

Pri beljakovinah, večjih od 80 kDa, priporočamo, da se SDS vključi v končni koncentraciji 0,1 %.

Prenosni pufer (polsuh)

• 48 mm Tris
• 39 mM glicin
• 20% metanola
• 0,04 % SDS

Medpomnilnik za blokiranje

3–5 % mleka ali BSA (goveji serumski albumin)

Dodaj v medpomnilnik TBST. Dobro premešamo in filtriramo. Neuspešno filtriranje lahko privede do madežev, kjer bodo drobna temna zrnca onesnažila madež med razvojem barve.

Liza vzorca

Priprava lizata iz celične kulture

1. Posodo s celično kulturo postavite na led in celice sperite z ledeno mrzlim PBS.
2. Aspirirajte PBS, nato dodajte ledeno hladen pufer za lizo (1 mL na 10 7 celic/100 mm posodo/150 cm 2 bučko; 0,5 mL na 5 x 10 6 celic/60 mm posodo/75 cm 2 bučko).
3. S strgalom za hladne plastične celice postrgajte sprijete celice s posode, nato pa celično suspenzijo nežno prenesite v predhodno ohlajeno mikrocentrifugirno epruveto. Alternativno lahko celice tripsiniziramo in speremo s PBS pred resuspendiranjem v pufru za lizo v epruveti za mikrocentrifugo.
4. Vzdržujte stalno mešanje 30 minut pri 4 °C.
5. Centrifugirajte v mikrocentrifugi pri 4 °C. Morda boste morali spreminjati silo in čas centrifugiranja glede na vrsto celice; smernica je 20 minut pri 12.000 obratih na minuto, vendar je to treba določiti za vaš poskus (levkociti potrebujejo zelo rahlo centrifugiranje).
6. Previdno odstranite epruvete iz centrifuge in jih postavite na led, aspirirajte supernatant in ga postavite v novo epruveto, ki jo hranite na ledu, ter zavrzite pelet.

Priprava lizata iz tkiv

1. Razrežite tkivo, ki vas zanima, s čistimi orodji, po možnosti na ledu, in čim hitreje, da preprečite razgradnjo s proteazami.
2. Tkivo postavite v mikrocentrifugirne epruvete z okroglim dnom ali Eppendorfove epruvete in potopite v tekoči dušik, da hitro zamrzne. Vzorce shranite pri -80 °C za kasnejšo uporabo ali jih hranite na ledu za takojšnjo homogenizacijo. Za ~5 mg kos tkiva v epruveto hitro dodajte ~300 μL ledeno mrzlega liznega pufra, homogenizirajte z električnim homogenizatorjem, dvakrat sperite rezilo z drugim 2 x 200 μL liznega pufra, nato vzdržujte konstantno mešanje 2 uri pri 4°C (npr. postavite na orbitalni stresalnik v hladilniku). Volumen liznega pufra je treba določiti glede na količino prisotnega tkiva; beljakovinski ekstrakt ne sme biti preveč razredčen, da preprečimo izgubo beljakovin in nalaganje velikih količin vzorcev na gele. Najmanjša koncentracija je 0,1 mg/ml, optimalna koncentracija je 1–5 mg/ml.
3. Centrifugirajte 20 minut pri 12.000 obratih na minuto pri 4 °C v mikrocentrifugi. Previdno odstranite epruvete iz centrifuge in jih postavite na led, aspirirajte supernatant in postavite v novo epruveto, ki jo hranite na ledu; zavrzite pelet.

priprava vzorca

1. Odstranite majhno količino lizata, da izvedete kvantifikacijski test beljakovin. Določite koncentracijo beljakovin za vsak celični lizat.
2. Določite, koliko beljakovin želite naložiti, in dodajte enak volumen 2X Laemmli vzorčnega pufra.​

   Priporočamo redukcijo in denaturacijo vzorcev z naslednjo metodo, razen če spletni podatkovni list protiteles kaže, da je treba uporabiti pogoje brez redukcije in denaturacije.

3. Za redukcijo in denaturacijo vzorcev kuhajte vsak celični lizat v pufru za vzorce pri 100 °C 5 minut. Lizate je mogoče alikvotirati in shraniti pri -20 °C za prihodnjo uporabo.

1. V vdolbinice gela SDS-PAGE naložite enake količine beljakovin skupaj z markerjem molekulske mase. Naložite 20–30 μg skupnih beljakovin iz celičnega lizata ali tkivnega homogenata ali 10–100 ng prečiščenih beljakovin.
2. Pustite gel delovati 1–2 uri pri 100 V.

T Čas in napetost lahko zahtevata optimizacijo. Priporočamo, da upoštevate navodila proizvajalca. Uporabiti je treba redukcijski gel, razen če so na podatkovnem listu protiteles priporočeni pogoji brez redukcije.

Potreben odstotek gela je odvisen od velikosti beljakovine, ki vas zanima:

Lahko se uporabljajo tudi gradientni geli.

​Prenos proteina iz gela na membrano

Membrana je lahko iz nitroceluloze ali PVDF. Aktivirajte PVDF z metanolom za 1 minuto in sperite s pufrom za prenos, preden pripravite sklad. Čas in napetost prenosa bosta morda zahtevala nekaj optimizacije. Priporočamo, da upoštevate navodila proizvajalca. Prenos proteinov na membrano je mogoče preveriti z barvanjem s Ponceau S pred korakom blokiranja.

Zloženko pripravite na naslednji način:

Slika 1. Primer pripravljenega sklada.

Barvanje protiteles

1. Blokirajte membrano 1 uro pri sobni temperaturi ali čez noč pri 4 °C z uporabo blokirnega pufra.
2. Inkubirajte membrano z ustreznimi razredčinami primarnega protitelesa v pufru za blokiranje. Priporočamo inkubacijo čez noč pri 4 °C; druge pogoje je mogoče optimizirati.
3. Inkubirajte membrano s priporočeno razredčino konjugiranega sekundarnega protitelesa v blokirnem pufru pri sobni temperaturi 1 uro.
4. Membrano sperite s tremi izpiranji TBST, vsako po 5 minut.
5. Za razvoj signala upoštevajte priporočila proizvajalca kompleta. Odstranite odvečni reagent in pokrijte membrano s prozorno plastično folijo.
6. Pridobite sliko s tehnikami razvijanja v temnici za kemiluminiscenco ali običajnimi metodami skeniranja slike za kolorimetrično odkrivanje.

Uporabne povezave

Vsi pasovi: beta aktinsko protitelo - kontrola obremenitve (ab8227) pri razredčitvi 1/5000

Proga 1: izvleček celih celic HeLa
Proga 2: Izvleček celic kvasovk
Proga 3: Lizat mišjega možganskega tkiva

• Oglejte si naš seznam razpoložljivih lizatov pozitivne kontrole, blokirnih peptidov in proteinov pozitivne kontrole.
• Ogled izjemnih western blotov.

Protokole zagotavlja Abcam "TAKŠNI, KAKŠNI SO" na podlagi eksperimentiranja v Abcamovih laboratorijih z uporabo Abcamovih reagentov in izdelkov; vaši rezultati uporabe protokolov izven teh pogojev se lahko razlikujejo.

Zapis spletnega seminarja

Namen western blota je ločiti proteine ​​na gelu glede na molekulsko maso. Proteini se nato prenesejo na membrano, kjer jih je mogoče odkriti s protitelesi. Vzorce segrevajte pri 95 stopinjah C pet do deset minut v pufru za vzorce, ki vsebuje redukcijsko sredstvo, kot je beta merkaptoetanol. Posledica tega so linearizirani proteini z negativnim nabojem, sorazmernim z njihovo velikostjo.

Postavite gel v posodo za elektroforezo in dodajte pufer, pri čemer zagotovite, da so vrhovi vdolbinic pokriti. Odstotek akrilamida v uporabljenem gelu je odvisen od molekulske mase ciljnega proteina. Povežite trg z molekulsko maso v prvi pas in nato naložite vzorce v sosednje vdolbinice. Vsi vzorci, ki so vsebovali enake količine beljakovin. Ko so vsi vzorci naloženi, ad tekoči pufer, postavite pokrov na posodo za elektroforezo. Vklopite napajanje in nastavite napetost, ki jo priporoča proizvajalec gelov v rezervoarju za gel. Morali bi videti mehurčke, ki se dvigajo skozi rezervoar. Gel izvajajte, dokler se sprednji del matrice ne premakne dovolj navzdol po gelu.

Naslednja faza je prenos proteinov iz gela na membrano. Membrane so običajno izdelane iz nitroceluloze ali PVDF. Odstranite gel iz rezervoarja in ga previdno sprostite iz plastičnega ohišja. Izrežite jamice in nogo gela ter postavite gel v pufer za prenos. Pripravite sveženj za prenos tako, da membrano in gel vstavite med filtrirni papir in gobice. Membrani je treba slediti do pozitivne elektrode in gela, ki je najbližje negativni elektrodi. Z majhnim valjčkom odstranite vse mehurčke med gelom in membrano. Zaprite ohišje prenosa in ga potopite v rezervoar za prenos, ki vsebuje pufer za prenos. Dodajte vodo v zunanjo komoro, da bo sistem ohlajen, in ga pokrijte. Vklopite napajanje, da začnete prenos beljakovin. Čas in napetost zahtevata optimizacijo, zato si oglejte navodila proizvajalca.

Zdaj, ko so se proteini preselili iz gela na nitrocelulozno membrano, lahko beljakovino, ki nas zanima, zaznamo kot protitelo. Membrano lahko odstranite iz kasete in zdaj bi moral biti viden trg molekulske mase. Po potrebi lahko prenos proteinov potrdimo z barvanjem membrane z raztopino. Da bi preprečili nespecifično vezavo protitelesa, je treba membrano blokirati. Nalijte blokirni pufer na membrano in nežno pretresite z gugalnico. Običajno se to naredi z raztopino petodstotnega mleka ali govejega serumskega albumina, BSA, dve uri pri sobni temperaturi ali čez noč pri štirih stopinjah. Čas in vrsto blokirnega pufra je treba optimizirati, zato za podrobnosti preverite podatkovni list primarnega protitelesa, ki ga nameravate uporabiti.

Ko je membrana blokirana, odstranite blokirni pufer in v isto raztopino dodajte razredčeno primarno protitelo. Inkubirajte na gugalnici kot prej. Običajno primarne inkubacije protiteles trajajo eno uro pri sobni temperaturi ali čez noč pri štirih stopinjah C. Koncentracijo protiteles in čas inkubacije bo treba optimizirati. Za navodila glejte podatkovni list protiteles. Odlijte primarno protitelo in dvakrat sperite membrano v pralnem pufru. Sledite enemu 15-minutnemu pranju in trem 10-minutnim umivanjem na gugalnici. Pralni pufer je navadno Trys pufrirana fiziološka raztopina, TBS, ali fosfatno pufrirana fiziološka raztopina, PBS, z 0,1 odstotka tween 20.

Odlijte pralni pufer in inkubirajte membrano v konjugacijskem sekundarnem protitelesu, ki je bilo razredčeno v blokirnem pufru. Običajno se to izvaja eno uro pri sobni temperaturi, vendar bo treba optimizirati koncentracijo protiteles in čas inkubacije. Odstranite sekundarno protitelo in sperite membrano, kot je bilo prikazano prej.

Obstaja več različnih sistemov za odkrivanje. Če se sekundarna protitelesa konjugirajo v encim, pred slikanjem inkubirajte membrano v ustreznem substratu. Če so sekundarna protitelesa fluorescentni konjugati, lahko preidete neposredno na korak slikanja. Slikanje se lahko izvede z rentgenskim filmom ali z digitalnim slikovnim sistemom. Postavite membrano v pladenj za slikanje. Postavite pladenj za preslikovanje v sistem za preslikovanje. Čase izpostavljenosti bo najverjetneje treba optimizirati, da bi jasno zaznali pasove, ki se nanašajo na beljakovine, ki nas zanimajo.

Piskanje(iz angleščine " madež" - spot) - prenos NK, beljakovin in lipidov na trden substrat, na primer membrano in njihovo imobilizacijo.

• elektroforeza v poliakrilamidnem gelu:
o v denaturacijskih pogojih z dodatkom sečnine - ločevanje kratkih enoverižnih NA;
o v denaturacijskih pogojih z dodatkom natrijevega dodecil sulfata (Laemmlijeva elektroforeza) - ločevanje proteinov po molekulski masi;
o v nativnih razmerah - ločevanje proteinov glede na tridimenzionalno strukturo;
• izoelektrično fokusiranje - za ločevanje proteinov po izoelektrični točki (pI);
• dvodimenzionalna (2D) elektroforeza - za ločevanje proteinov v dveh smereh - po izoelektrični točki in po molekulski masi;
• elektroforeza v agaroznem gelu - NC separacija:
o po dolžini linearnih fragmentov;
o s "superzvijanjem" obročnih molekul;
• tankoplastna kromatografija - ločevanje lipidov iz lipidnih kompleksov.

• difuzija molekul - počasen transport, pogosto uporabljen za lipide;
• kapilarno blotiranje - membrano pritisnemo na gel, nanjo položimo kup filtrirnega papirja, pufer za prenos navlaži gel in se pod delovanjem kapilarnih sil dvigne, zmoči filtrirni papir in prenese makromolekule iz gela v membrana; kapilarno blotiranje se lahko izvede:
o v komorah z vlažilnim gelnim pufrom - "polsuhi" prenos;
o v komorah s potopitvijo gela v pufer;

• vakuumsko blotiranje - podobno kapilarnemu blotiranju, vendar se prenos pospeši z uporabo vakuuma namesto kapilarnih sil, ki nastanejo z močenjem filtrirnega papirja;
• elektroblotiranje - prenos nabitih makromolekul na membrano poteka pod vplivom električnega toka;
• "šivanje" NK na membrano pod vplivom UV sevanja ali segrevanja - za končno pritrditev na najlonske membrane;
• dot blotting (slot blotting) - vzorec nanesemo v obliki pike ali črtice neposredno na membrano brez predhodnega ločevanja molekul v gelu ali na TLC ploščo.

• PVDF membrane (poliviniliden fluorid);
• NC membrane (nitroceluloza);
• najlonske membrane (uporabljajo se za NDT).

• barvanje - vezava barvila (srebrovi ioni, Coomassie, Ponceau, etidijev bromid) neposredno z zaznavnimi makromolekulami;
• imunokemično označevanje - označevanje makromolekul se pojavi zaradi označenih protiteles, ki se specifično vežejo nanje, detekcija se izvaja:
o imunsko barvanje - protitelesa označimo z barvili, zabeležimo absorpcijo svetlobe določene valovne dolžine;
o encimski imunosorbent - protitelesa označimo z encimom, zabeležimo količino obarvanega produkta, ki nastane med encimsko reakcijo (ELISA);
o kemiluminiscentna - protitelesa so označena z reporterskim encimom, ki v prisotnosti substrata oddaja luminiscenco, zabeleži se emisija svetlobe.
določena valovna dolžina;
o fluorescenčna - protitelesa so označena s fluorescentno oznako, ki jo vzbuja svetloba določene valovne dolžine, sevanje svetlobe beležimo v
območje daljše valovne dolžine;
• označevanje sevanja - v makromolekule se vnesejo radiacijske oznake (radioizotopi), detekcija poteka z:
o avtoradiografija (nanos filma na membrano);
o radijsko slikanje (kvantitativno določanje emisije sevanja in izdelava slike relativnega položaja oznak);
• hibridizacija - vezava nukleinskih kislin z označenimi oligonukleotidi s komplementarno strukturo, detekcija se praviloma izvede s snemanjem emisije sevanja ali fluorescence oznake;
• masna spektrometrija – uporablja se za direktno strukturno analizo lipidov.

• Southern blotting(Southern blotting) - po imenu Edwin Southern, ki je predlagal metodo - določanje zaporedja DNK v vzorcu in določanje števila kopij genov v genomski DNK. Pred prenosom na membrano sledi razgradnja vzorca z restrikcijskimi endonukleazami na fragmente in njihova frakcioniranje z elektroforezo v agaroznem gelu. Membransko analizo izvedemo s hibridizacijo z označenimi oligonukleotidi znanega zaporedja;
• Northern blotting- določanje zaporedja RNA v vzorcu in študij izražanja genov (določanje mRNA). Podobno kot Southern blotting, vendar se pregledajo molekule RNA, izolirane iz vzorca, brez cepitve z endonukleazami. Ločevanje molekul poteka v agaroznem gelu z dodatkom formaldehida (za denaturacijo RNA) ali v poliakrilamidnem gelu z dodatkom sečnine (uporablja se za analizo mikroRNA). Imobilizacija molekul RNA na membrani nastane zaradi segrevanja pod vakuumom ali "šivanja" z UV obsevanjem;
• Western blotting- proteinski imunobloting - analitična metoda za določanje specifičnih proteinov v vzorcu. Pred prenosom na membrano se proteini ločijo v poliakrilamidnem gelu. Analiza proteinov na membrani poteka imunokemično;
• Far Western blotting- protein blotting, ki se uporablja za določanje interakcij protein-protein, podobno kot Western blotting, vendar se namesto protiteles uporabljajo drugi proteini, ki se specifično vežejo na proučevani protein;
• jugozahodno pikanje- določanje proteinov, ki vežejo DNA, in mest za vezavo proteinov v molekulah DNA - podobno kot Western blot, le da se po elektroforezi v denaturacijskem poliakrilamidnem gelu proteini ob prisotnosti sečnine sperejo z natrijevega dodecil sulfata in z difuzijo prenesejo na nitrocelulozno membrano. Kot vzorec uporabimo označene fragmente DNA različnih dolžin, pridobljene s cepitvijo večjega preučevanega fragmenta genomske DNA. Vezane molekule DNA se nato izperejo iz vsakega kompleksa protein-DNA in analizirajo z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu;
• Eastern blotting- določanje posttranslacijskih modifikacij proteinov (lipidi, glikopolisaharidi, z njimi povezani fosfatni ostanki) - podobno kot Western blotting, vendar se protitelesa ne uporabljajo proti proteinom, ampak proti lipidom, glikopolisaharidom itd. Poleg protiteles se kot vzorci uporabljajo tudi druge proteinske molekule, ki se vežejo na proučevane (na primer lektin);
• Blotting z Daljnega vzhoda- analiza lipidov, ločenih s tankoplastno kromatografijo visoke ločljivosti. Prenos na membrano se praviloma izvede z difuzijo. Registracija poteka z neposredno masnospektrometrično strukturno analizo.