Բովանդակություն

OFS.1.7.2.0022.15 Իմունոկենսաբանական դեղամիջոցների իսկության և մաքրության որոշում Western blot-ով

ԸՆԴՀԱՆՈՒՐ ԴԵՂԱԳՈՐԾԱԿԱՆ ԼԻԶՈՐԱՑՈՒՄ

Ներկայացվել է առաջին անգամ

Ընդհանուր դեղագրքի այս մենագրությունն ընդգրկում է Western blot մեթոդը՝ իմունոբլոտի մեթոդներից մեկը, որն օգտագործվում է բարձր մաքրված սպիտակուցների վրա հիմնված իմունոկենսաբանական դեղամիջոցների (ILPs) իսկությունը և մաքրությունը գնահատելու համար, ներառյալ՝ նրանք, որոնք ստացվել են ռեկոմբինանտ ԴՆԹ տեխնոլոգիայի միջոցով:

Առաջին քայլը էլեկտրոֆորեզն է պոլիակրիլամիդ գելում նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատով (այսպես կոչված SDS-PAGE էլեկտրոֆորեզ)՝ սպիտակուցների առանձնացման համար: Այնուհետև սպիտակուցները տեղափոխվում են նիտրոցելյուլոզային թաղանթ կամ PVDF թաղանթ (պոլիվինիլիդեն ֆտորիդ թաղանթ): Հայտնաբերումն իրականացվում է որոշվող սպիտակուցին հատուկ հակամարմինների միջոցով՝ կապված ալկալային ֆոսֆատազի կամ ծովաբողկի պերօքսիդազի հետ (ուղիղ ELISA) կամ հաջորդաբար օգտագործելով որոշվող սպիտակուցի առաջին հակամարմինները, իսկ երկրորդ հակամարմինները (այսպես կոչված հակագլոբուլինային շիճուկը) հատուկ։ առաջին հակամարմինների իմունոգոլոբուլինին` կապված ալկալային ֆոսֆատազի կամ ծովաբողկի պերօքսիդազի հետ (անուղղակի ELISA):

Այս GPM-ը նկարագրում է հայտնաբերման մեթոդը, որը հիմնված է գունային ռեակցիայի վրա, որպես ներկայումս ամենատարածվածներից մեկը: Հայտնաբերման համար կարող են օգտագործվել նաև քիմիլյումինեսցենտային մեթոդը, ներառյալ ուժեղացված քիմիլյումինեսցենտները և ռադիոակտիվ կամ լյումինեսցենտային պիտակների (RIA կամ RIF) մեթոդները:

Թեստն իրականացվում է դեղագործական նյութերով կամ պատրաստի արտադրանքով։

Իսկությունը գնահատելիս, էլեկտրոֆորեզի կատարման փուլում, փորձարկման նմուշներից բացի, գելային հորերին պետք է ավելացվեն հետևյալ լուծույթները՝ բացասական հսկողության նմուշ (1x նմուշի պատրաստման բուֆեր), մոլեկուլային քաշի մարկերների խառնուրդ (նախապես ներկված): Առաջարկվում են մոլեկուլային քաշի մարկերներ), ստուգված սպիտակուցի ստանդարտ նմուշ (եթե այդպիսիք կան), վավերացված սահմանված կարգով: Մաքրությունը (կեղտերը) գնահատելիս պետք է լրացուցիչ նախատեսվի սպիտակուցի կոնցենտրացիայով նմուշի ներմուծում, որը համապատասխանում է կեղտոտության հայտնաբերման կամ քանակական սահմանին (կախված մեթոդի նպատակից) և սահմանվում է հիման վրա: մեթոդի վավերացման արդյունքները: Մաքրությունը գնահատելիս անհրաժեշտ է համեմատել բլոտի արդյունքները պոլիակրիլամիդ գելի մեջ էլեկտրոֆորեզի արդյունքների հետ; տեխնիկան պետք է հայտնաբերի աղտոտվածության 1%-ը:

Մեթոդաբանությունը

Սպիտակուցներն ըստ իրենց մոլեկուլային քաշի առանձնացնելու համար էլեկտրոֆորեզը նախապես իրականացվում է «Էլեկտրոֆորեզ պոլիակրիլամիդ գելերում» Ընդհանուր դեղագրության մենագրության մեջ նկարագրված ընթացակարգի համաձայն:

Սպիտակուցի փոխանցման սարքը օգտագործվում է սպիտակուցի տեղափոխման համար: Բոլոր աշխատանքները կատարվում են ռետինե ձեռնոցներով։ Օգտագործված բոլոր լուծույթների ծավալը պետք է բավարար լինի թաղանթն ամբողջությամբ սուզելու համար, որի վրա տեղափոխվում են սպիտակուցները:

Գելը իմունոբլոտինգի պատրաստման համար էլեկտրոֆորեզից հետո այն լցվում է բուֆերային լուծույթով՝ սպիտակուցի փոխանցման համար (եթե այլ բան նշված չէ մենագրության մեջ կամ կարգավորող փաստաթղթերում), տեղադրվում է ուղեծրային շեյքերի վրա և ինկուբացվում 10-15 րոպե: Այնուհետև պատրաստվում է նիտրոցելյուլոզային կամ PVDF թաղանթ, որը համապատասխանում է գելի չափին: Նիտրոցելյուլոզային թաղանթ օգտագործելիս թերթիկը ինկուբացվում է 5 րոպե դեիոնացված ջրի մեջ, այնուհետև 5 րոպե սպիտակուցի փոխանցման բուֆերային լուծույթում (եթե այլ բան նշված չէ մենագրության մեջ կամ նորմատիվ փաստաթղթերում): PVDF թաղանթ օգտագործելիս այն պետք է 10-15 րոպե պահել մեթանոլի կամ ալկոհոլի լուծույթում, այնուհետև կատարել նույն քայլերը, ինչ նիտրոցելյուլոզային թաղանթի դեպքում։

«Սենդվիչ» հավաքվում է սպիտակուցները նիտրոցելյուլոզային կամ PVDF թաղանթին փոխանցելու համար: Դրա համար սպիտակուցի փոխանցման գործիքի հետ ներառված հատուկ սպունգը թրջվում է սպիտակուցի փոխանցման բուֆերի մեջ և տեղադրվում հատուկ պլաստիկ շրջանակի վրա, որի վրա ֆիլտրի թղթի մեկից երեք թերթ (օրինակ՝ Whatman 3MM), նախապես կտրվում է ըստ թաղանթի։ չափը և սպիտակուցները՝ ներծծված փոխանցման լուծույթում: Վերևում դրվում է գել, որի մակերեսին զգուշորեն (առանց օդային փուչիկների) տեղադրվում է նիտրոցելյուլոզային կամ PVDF թաղանթի պատրաստված թերթիկը։ Սպիտակուցի փոխանցման լուծույթով նախապես ներծծված ֆիլտրի մեկից երեք թերթիկները տեղադրվում են թաղանթի վրա և ծածկվում սպիտակուցի փոխանցման լուծույթով թաթախված երկրորդ հատուկ սպունգով։ Շրջանակը սեղմվում է միմյանց և դանդաղորեն ընկղմվում է էլեկտրոֆորեզի ապարատի մեջ, որը լցված է սպիտակուցի փոխանցման լուծույթով, թաղանթային թերթիկը նայում է անոդին: Միացրեք սարքը: Սպիտակուցների էլեկտրաֆորետիկ փոխանցումն իրականացվում է սենյակային ջերմաստիճանում 25 րոպե, ընթացիկ սահմանը սահմանելով A max = 2 mA/cm 2 արագությամբ (օրինակ, 10 × 10 սմ 2 չափի գելի համար, A max = 200 mA: ), եթե այլ բան նշված չէ դեղագրքի հոդվածում կամ նորմատիվ փաստաթղթերում:

Թույլատրվում է օգտագործել սպիտակուցների գելից թաղանթ կիսաչոր փոխանցման սարքավորում՝ դրա օգտագործման հրահանգներին համապատասխան:

Տրանսֆերի վերջում «սենդվիչը» ապամոնտաժվում է։ Թաղանթը լվանում են ֆոսֆատով բուֆերացված ֆիզիոլոգիական լուծույթով (PBS):

Սպիտակուցի փոխանցման ամբողջականությունը տեսողականորեն գնահատվում է մոլեկուլային քաշի գունավոր մարկերների փոխանցմամբ, որոնց բոլոր հիմնական սպիտակուցային շերտերը պետք է հայտնաբերվեն թաղանթի վրա:

հայտնաբերում

Western blot մեթոդի արդյունքները հայտնաբերելու համար թեստի պատրաստումը մշակվում է (հիբրիդացված) հակամարմիններով։ Դա անելու համար դրա վրա փոխանցված սպիտակուցներով թաղանթը տեղադրվում է արգելափակող բուֆերային լուծույթով տարայի մեջ և 30-60 րոպե ինկուբացվում է ուղեծրային շեյքերի վրա (եթե այլ բան նախատեսված չէ մենագրության մեջ կամ կարգավորող փաստաթղթերում)՝ կանխելու հակամարմինների ոչ սպեցիֆիկ կլանումը: թաղանթը.

Դրանից հետո թաղանթը լվանում են բուֆերային լուծույթով երեք անգամ 5 րոպեով լվանալու համար, եթե այլ բան նշված չէ մենագրության մեջ կամ նորմատիվ փաստաթղթերում:

Այնուհետև թաղանթը մշակվում է վերլուծված սպիտակուցի առաջին հակամարմինների լուծույթով, որը պատրաստվում է հակամարմինների համար բուֆերային լուծույթով (եթե այլ բան նշված չէ մենագրության կամ կարգավորող փաստաթղթերում) անմիջապես օգտագործելուց առաջ՝ օգտագործման հրահանգներին համապատասխան: Հակամարմիններով բուժումն իրականացվում է սենյակային ջերմաստիճանում 30-60 րոպե (եթե այլ բան նշված չէ մենագրության մեջ կամ նորմատիվ փաստաթղթերում):

Այնուհետև թաղանթը երեք անգամ լվանում են 5 րոպե բուֆերային լուծույթով` սենյակային ջերմաստիճանում ուղեծրային շեյքերի վրա չկապված հակամարմինները հեռացնելու համար, եթե այլ բան նշված չէ մենագրության մեջ կամ կարգավորող փաստաթղթերում:

Մեմբրանը լվանալուց հետո բուժումը (հիբրիդացում) իրականացվում է երկրորդ հակամարմինի լուծույթով։ Որպես երկրորդ հակամարմիններ, օգտագործվում են պոլիկլոնալ հակամարմիններ կենդանիների տեսակների իմունոգոլոբուլինների նկատմամբ, որոնք օգտագործվում են առաջին հակամարմինները ստանալու համար: Այս հակամարմինները միացված են ֆերմենտի հետ (ծովաբողկի պերօքսիդազ կամ ալկալային ֆոսֆատազ): Այս քայլը կատարելու համար կրկնվում է վերը նկարագրված ընթացակարգը՝ փոխարինելով առաջին հակամարմինների լուծույթը երկրորդ հակամարմինների լուծույթով։ Այնուհետև մեմբրանի նմանատիպ առաջին լվացումն իրականացվում է չկապված երկրորդ հակամարմիններից:

Մեմբրանի վրա իմունոբլոտի ձևավորման ձևավորումն իրականացվում է տետրամեթիլբենզիդինի սուբստրատի (TMB) լուծույթով ծովաբողկի պերօքսիդազի հետ զուգակցված հակամարմինների համար կամ ալկալային ֆոսֆատազի զարգացման լուծույթով, երբ օգտագործվում են ալկալային ֆոսֆատազով հակամարմիններ (եթե այլ բան նշված չէ մենագրությունը կամ նորմատիվ փաստաթուղթը):

Ռեակցիան դադարեցվում է բլոտը դեիոնացված ջրով լվանալով: Հեռացրեք ավելորդ ջուրը թաղանթի մակերեսից ֆիլտր թղթով և չորացրեք օդում մութ տեղում:

Արդյունքների գնահատում

Իսկականությունը գնահատելիս մշակված թաղանթի վրա հիմնական գունավոր շերտերը պետք է համապատասխանեն էլեկտրոֆորոգրամի հիմնական գունավոր շերտերին:

Անալիտի քանակությունը և կեղտերի պարունակությունը, ինչպես նաև դրանց հարաբերակցությունը գնահատվում են դենսիտոմետրիկորեն:

Համակարգի համապատասխանության չափանիշներ

Western blot մեթոդի արդյունքները կարելի է հաշվի առնել, եթե.

մոլեկուլային քաշի մարկերները հավասարաչափ բաշխված են համապատասխան գելային գոտու ողջ երկարությամբ.
բլոտը ցույց է տալիս բոլոր հիմնական ժապավենները, որոնք հայտնաբերվել են Coomassie գելը վառ կապույտ R-250 կամ G-250 ներկելիս.
հայտնաբերվել է մենագրության կամ նորմատիվ փաստաթղթերում սահմանված նվազագույն կոնցենտրացիայով նմուշ

Ընդունման չափանիշները

Փորձանմուշի բլոտի համընկնումը տեղեկատու նմուշի բլոտի հետ, օրինակ՝ մաքրված սպիտակուցի (նյութի) վրա հիմնված համապատասխան ստանդարտ նմուշի.
հիմնական հայտնաբերված բաղադրիչի մոլեկուլային քաշի համապատասխանությունը բնութագրերի պահանջներին.
ստանդարտ նմուշում հայտնաբերված խառնուրդի պարունակության համապատասխանությունը ստանդարտ նմուշի համար վկայագրում սահմանված միջակայքին:

Վեսթերն բլոտի նույնականացման և մաքրության մեթոդը պետք է օգտագործվի վավերացված կատարողականությամբ՝ անմաքրության առանձնահատկությունների և հայտնաբերման սահմանի առումով:

Մեթոդի վավերացման առանձնահատկությունները

Իսկականության գնահատման մեթոդաբանություն կիրառելիս անհրաժեշտ է հիմնավորել արդյունքների ընդունելիության չափանիշները. Ցանկալի է օգտագործել ստանդարտ նմուշ, որը հիմնված է մաքրված սպիտակուցի վրա, որը վավերացված է սահմանված կարգով:

Մաքրությունը գնահատելու տեխնիկա օգտագործելիս անհրաժեշտ է հիմնավորել աղտոտվածության հայտնաբերման սահմանը: Քանակականացնելիս անհրաժեշտ է հիմնավորել անմաքրության քանակական որոշման սահմանը, նշել հիմնական բաղադրիչի և կեղտերի որոշման գծային միջակայքը, տեխնիկայի ճշգրտությունն ու կոռեկտությունը: Դրա համար նպատակահարմար է օգտագործել ստանդարտ նմուշ, որը հիմնված է մաքրված սպիտակուցի վրա: Մենագրության կամ նորմատիվ փաստաթղթերում նշված մեթոդի մեջ փոփոխություններ կատարելիս պետք է հաստատվեն նախկինում հաստատված մեթոդի վավերացման բնութագրերը: Հետևյալ փոփոխությունները ենթակա են վավերացման.

գելի վրա կիրառվող տարբեր քանակությամբ նմուշների օգտագործումը.
սպիտակուցների գելից թաղանթ տեղափոխելու պայմանների փոփոխություն, ներառյալ օգտագործվող սարքավորումները փոխելը.
բուֆերային լուծույթների կազմի փոփոխություններ;
փորձարկման նյութի հայտնաբերման մեթոդի փոփոխություն.

Նշումներ.

Սպիտակուցի փոխանցման բուֆեր pH 8.3:Եթե այլ բան նշված չէ մենագրության մեջ կամ նորմատիվ փաստաթղթերում, օգտագործվում է ստորև նկարագրված լուծումների պատրաստման մեթոդներից մեկը (տես Տարբերակ 1 և Տարբերակ 2): Փոխանցման լուծույթը կարող է օգտագործվել 2-3 անգամ։ Լուծույթը պահվում է 6 ամիս 4-ից 8 0 C ջերմաստիճանում։

Տարբերակ 1. 3000 մլ տարողությամբ աստիճանավոր գավաթում դրվում է 7,86 գ տրիս(հիդրօքսիմեթիլ)ամինոմեթան, 33,75 գ գլիցին, ավելացվում է մինչև 2400,0 մլ դեիոնացված ջուր և հարում մագնիսական հարիչի վրա մինչև ամբողջական լուծարումը։ Չափվում է pH-ը, որը պետք է հավասար լինի 8,3 - 8,4 (լուծույթի pH-ի կարգավորումը թթվով կամ ալկալով չի թույլատրվում): Ավելացնել 600,0 մլ սպիրտ եւ խառնել։

Տարբերակ 2. 5,8 գ տրիս(հիդրօքսիմեթիլ)ամինոմեթան, 2,9 գ գլիցին, 11,55 մլ 10% նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատի լուծույթ տեղադրվում են 1000 մլ տարողությամբ աստիճանավորված բաժակի մեջ, ավելացվում է 800,0 մլ դեիոնացված ջուր և հարում մագնիսական հարիչի վրա: ամբողջական տարրալուծում, pH չափվում է (8,3-8,4)։ Ավելացնել 200,0 մլ 100% մեթանոլ և խառնել։ Եթե օգտագործվում է PVDF թաղանթ, ապա նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատը բացառվում է բուֆերային լուծույթից, իսկ սպիրտի քանակը կրճատվում է մինչև 100,0 մլ, դրանով իսկ ավելացնելով ավելացված ջրի ծավալը մինչև 900,0 մլ:

Ֆոսֆատ-աղի բուֆերային լուծույթ (PBS), pH 7.2(եթե մենագրության կամ նորմատիվ փաստաթղթերում այլ ցուցումներ չկան): 4500,0 մլ դեիոնացված ջուր լցնում են աստիճանավորված տարայի մեջ և հաջորդաբար ավելացնում՝ 40,0 գ նատրիումի քլորիդ, 1,0 գ կալիումի քլորիդ, 5,75 գ նատրիումի ֆոսֆատ՝ փոխարինված 2-ջուր, 1,0 գ նախորդի ամբողջական լուծարումը): pH-ը 70% ֆոսֆորաթթվի լուծույթով կամ 45% նատրիումի հիդրօքսիդի լուծույթով կարգավորվում է մինչև 7,2: Ծավալը հարմարեցվում է 5000.0 մլ-ի՝ դեիոնացված ջրով: Լուծույթը ֆիլտրում են և պահում 3 ամիս 4 - 8 0 C ջերմաստիճանում։
Լվացքի բուֆեր. 1000 մլ տարողությամբ ծավալային կոլբայի մեջ ավելացնել 5,0 մլ թվին-20 10% լուծույթ, լուծույթի ծավալը PBS-ով հասցնել նշագծին և խառնել։ Լուծույթը պահվում է 1 ամիս 4 °C-ից 8 °C ջերմաստիճանում։
արգելափակող բուֆերային լուծույթ: 100,0 մլ լվացքի բուֆերին ավելացրեք 5,0 մգ տավարի շիճուկի ալբումին (կամ այլ սպիտակուց), եթե այլ բան նշված չէ մենագրության մեջ կամ նորմատիվ փաստաթղթերում, և խառնեք մինչև ամբողջովին լուծարվի: Լուծումը պատրաստվում է օգտագործելուց առաջ։
Բուֆերային լուծույթ հակամարմինների համար: 100,0 մլ լվացքի բուֆերին ավելացրեք 2,0 մգ տավարի շիճուկ ալբումին (կամ այլ սպիտակուցներ), եթե այլ բան նշված չէ մենագրության կամ նորմատիվ փաստաթղթերում, և խառնեք մինչև ամբողջովին լուծարվի: Լուծումը պատրաստվում է օգտագործելուց առաջ։

TMB լուծում- լուծույթ ծովաբողկի պերօքսիդազի դրսևորման համար. Օգտագործեք TMB-substrate, պատրաստ օգտագործման համար:
Ալկալային ֆոսֆատազի դրսևորման լուծույթ. BCIP/NBT սուբստրատի 1 դեղահատ լուծեք 10,0 մլ դեիոնացված ջրի մեջ: Լուծումը պատրաստվում է օգտագործելուց անմիջապես առաջ։

Հենց որ ԴՆԹ-ն, ՌՆԹ-ն կամ սպիտակուցները բաժանվեն, դրանք պետք է տեղափոխվեն ամուր հենարան՝ հայտնաբերելու և գելում դժվարին այլ գործողությունների համար: Տեղափոխման գործընթացը տանում է դեպի մոլեկուլների անշարժացում , այսինքն. ֆիքսացիա անշարժ վիճակում կոչվում է blotting (Անգլերեն. - blotting ) Որպես հիմք օգտագործվում են նեյլոնե կամ նիտրոցելյուլոզային թաղանթներ։

Բլոտինգ(անգլերեն blotting - blotting) էլեկտրոֆորետիկ ԴՆԹ-ի բեկորները նիտրոցելյուլոզից պատրաստված հատուկ թաղանթ (թաղանթ) փոխանցելու մեթոդ է, որը կապում է (անշարժացնում) միաշղթա ԴՆԹ-ի մոլեկուլները։

Հարավային բլոտինգ(այն առաջարկող հեղինակի անունով) հիմնված է ԴՆԹ-ի բեկորների շարժման վրա՝ մազանոթային ազդեցության պատճառով։ ԴՆԹ-ի բեկորները ագարոզայի գելի մեջ նիտրոցելյուլոզային թաղանթի վրա ֆիլտրի թղթի միջոցով փոխանցելու գործընթացը նման է բլոտինգին:

Վերլուծությունն իրականացվում է հետևյալ կերպ.

– Մեկուսացված, մաքրված, դենատուրացված և մասնատված ԴՆԹ-ն տեղադրվում է ագարոզայի գելի թերթիկի վրա, որտեղ բեկորները զանգվածով և լիցքով բաժանվում են էլեկտրաֆորեզի միջոցով:

– Ագարոզայի գել թերթիկը դրվում է խտացված աղի (բուֆեր) լուծույթով խոնավացված ֆիլտրի թղթի վրա:

- Այնուհետև գելի վրա կիրառվում է նիտրոցելյուլոզային ֆիլտր, որտեղ տեղի է ունենում միաշղթա ԴՆԹ-ի բեկորների անշարժացում (կամ ադսորբցիա կամ ֆիքսացիա):

- Ֆիլտրի վրա դրվում է չոր զտիչ թղթի թերթիկների կույտ, որն ապահովում է բուֆերային լուծույթի դանդաղ հոսքը գելի միջով (այսինքն՝ ծառայում է որպես մի տեսակ մազանոթ պոմպ): Աղի լուծույթը, անցնելով ագարոզայի գելի միջով, տանում է ԴՆԹ-ի բեկորները, որոնք պահվում են նիտրոցելյուլոզով և կապվում դրան, իսկ լուծույթը ներծծվում է չոր ֆիլտրի թղթով:

– Այնուհետև ԴՆԹ-ն այլասերվում է ալկալիով, և ֆիլտրը պահվում է վակուումում 80 0 C ջերմաստիճանում, ինչի արդյունքում միաշղթա ԴՆԹ-ի բեկորներն անշրջելիորեն անշարժացվում են (ամրացվում) նիտրոցելյուլոզայի վրա։ Այս դեպքում անշարժացած ԴՆԹ-ի շերտերի դասավորությունը ճշգրտորեն համապատասխանում է գելի մեջ դրանց տեղակայմանը:

– Զտիչին կապակցված ԴՆԹ-ն տեղադրվում է պիտակավորված ԴՆԹ հետազոտությամբ լուծույթի մեջ, որում տեղի է ունենում հիբրիդացում: Միայն դրան լրացնող ԴՆԹ-ի բեկորները կհիբրիդացվեն (ջրածնային կապեր) հատուկ զոնդով, որը կարող է հայտնաբերվել ռենտգենյան թաղանթի վրա որպես թեթև շերտեր, այսինքն. Նիտրոցելյուլոզային ֆիլտրի ինքնագիր

dot blotting. Կետային բլոտներ պատրաստելու համար ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի պատրաստումը ուղղակիորեն կիրառվում է ֆիլտրի վրա: Դեղամիջոցի կաթիլները ֆիլտրի վրա նման են կետերի, ինչը բացատրում է բլոտի տեսակի անվանումը (անգլերեն կետ - կետ): 1) 5–10 բազային զույգ երկարությամբ բեկորներ են ձևավորվում գենոմային ԴՆԹ-ից, որը նախապես մշակվել է ուլտրաձայնով:

2) ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի զոնդերը զոնդին հասանելի դարձնելու համար դրանք պետք է դենատուրացված լինեն, այսինքն. վերածվել է միաշղթա ձևի: Դա տեղի է ունենում 100 ° C ջերմաստիճանի ազդեցության տակ:

3) Դենատուրացված նուկլեինաթթուները ինկուբացվում են սառույցի վրա. ջերմաստիճանի արագ նվազումը կանխում է դրանց վերածումը, այսինքն. շղթաների լրացուցիչ զուգավորում: Դենատուրացված ԴՆԹ-ն կամ ՌՆԹ-ն ուղղակիորեն կիրառվում է ֆիլտրի վրա, որը ինկուբացվում է զոնդ պարունակող լուծույթում:

4) Որպեսզի վերլուծված նուկլեինաթթուն չմտնի լուծույթ, այն պետք է ամրացվի ֆիլտրի (թաղանթի) վրա։ Դրա համար օգտագործվում են երկու տեսակի ֆիլտրեր՝ նիտրոցելյուլոզ և նեյլոն։

Նուկլեինաթթուները նիտրոցելյուլոզային ֆիլտրի վրա անշարժացնելու համար օգտագործվում է վակուումում 80 °C-ում տապակել, իսկ նեյլոնե ֆիլտրի վրա՝ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթում 3–5 րոպե։

5) Նուկլեինաթթվի պատրաստուկը իզոտոպով պիտակավորված զոնդով ինկուբացիայից հետո կատարվում է ավտոռադիոգրաֆիա հատուկ ձայներիզով կամ նույնականացում ոչ ռադիոակտիվ մեթոդներով.

Dot blotting-ը թույլ է տալիս պատասխանել միայն մեկ հարցին՝ կա արդյոք տվյալ նմուշում ցանկալի նուկլեոտիդային հաջորդականություն:

Հյուսիսային բլոտի վերլուծությունկիրառվում է:

1) ՌՆԹ-ի մեկուսացման և վերլուծության համար (օրինակ՝ պարզելու, թե արդյոք տվյալ գենից կարդացված mRNA-ն առկա է տվյալ բջիջի տիպում, այսինքն՝ գենը արտահայտված է, թե ոչ.

2) որոշել այս ՌՆԹ-ի քանակությունը և դրա փոփոխությունները տվյալ բջջի տեսակի զարգացման մեջ.

3) որոշ գենի տրանսկրիպտի չափը որոշելու համար.

Այս դեպքում բջջից մեկուսացված ՌՆԹ-ի մոլեկուլները բաժանվում են ըստ չափերի՝ օգտագործելով գելային էլեկտրոֆորեզ և այնուհետև տեղափոխվում ֆիլտր: Նշված միաշղթա զոնդով հիբրիդացումից հետո բացահայտվում են ՌՆԹ-ի և զոնդի հիբրիդացման (հոմոլոգիայի) վայրերը:

Եթե ցանկալի գենի (կամ mRNA) նուկլեոտիդային հաջորդականությունը հայտնի չէ, բայց հայտնի է այն սպիտակուցը, որի սինթեզը այն վերահսկում է, ապա կարելի է առանձնացնել մաքուր սպիտակուցի փոքր քանակություն, կարելի է որոշել դրա որոշ մասերի ամինաթթուների հաջորդականությունը: 5-6 ամինաթթուների մնացորդների իմացությունը բավարար է): Օգտագործելով գենետիկ կոդի աղյուսակը՝ հնարավոր է հաստատել բոլոր հնարավոր նուկլեոտիդային հաջորդականությունները mRNA-ի այն հատվածում (կամ հենց գենում), որը կոդավորում է տվյալ ամինաթթուների հաջորդականությունը։ Այս դեպքում կարող է սինթեզվել զոնդ՝ գեների գրադարանում ցանկալի կլոնները որոնելու համար:

Western blottinԳ(իմունոէլեկտրոբլոտինգ, սպիտակուցային բլոթինգ) յուրահատուկ սպիտակուցների նույնականացման մեթոդ է: Այն հիմնված է բարձր սպեցիֆիկ հակագեն-հակամարմին փոխազդեցության երևույթի վրա: Այսպիսով, հակագենը (թիրախը) որոշվող սպիտակուցն է, իսկ զոնդը՝ դրա հակամարմինը։

Ուսումնասիրվող սպիտակուցի հակամարմինները ստացվում են տարբեր ձևերով: Ամենապարզը լաբորատոր կենդանու (սովորաբար նապաստակի) արյան մեջ մաքրված սպիտակուցի նմուշի ներմուծումն է: Նրա մարմնում հակամարմիններ (իմունոգոլոբուլիններ) արտադրվում են այս օտար սպիտակուցի նկատմամբ։ Սրանք առաջնային հակամարմիններն են, որոնք փոխազդելու են թիրախային սպիտակուցի հետ:

Այնուամենայնիվ, ռացիոնալ չի լինի ուղղակիորեն այդ հակամարմինների մեջ նույնականացման պիտակ ներմուծել: Տարբեր սպիտակուցներ հայտնաբերելու համար անհրաժեշտ կլիներ տարբեր հակամարմիններ պիտակավորել, ինչը կհանգեցներ դրանց բարձր գնի: Պարզվեց, որ ավելի խելամիտ է օգտագործել ունիվերսալ հակամարմիններ – կոնյուգացված հակաիմունոգոլոբուլիններ, որոնք, ըստ էության, հակամարմիններ են հակամարմինների դեմ, որոնք արտադրվում են ճանաչելի սպիտակուցի որպես հակագեն օգտագործելու միջոցով: Օրինակ, նապաստակի Ig-ի հետ կապված հակաիմունոգոլոբուլինները փոխազդում են նապաստակի մեջ տարբեր անտիգենների համար սինթեզված բոլոր իմունոգլոբուլինների հետ: Այսպիսով, այս ունիվերսալ երկրորդական հակամարմիններն են, որոնք կրում են իզոտոպային կամ ոչ ռադիոակտիվ պիտակ: Ի լրումն ոչ իզոտոպային պիտակի, որը մի շարք ռեակցիաների ընթացքում հանգեցնում է չլուծվող գունավոր միացության առաջացմանը (ինչպես նուկլեինաթթվի բլոտինգի դեպքում), շատ հաճախ օգտագործվում է ավելի բարձր զգայունությամբ քիմլյումինեսցենտային պիտակ:

1) սպիտակուցների արդյունահանում միատարրից

2) Սպիտակուցների բաժանումը մոլեկուլային կշիռներով՝ օգտագործելով SDS-էլեկտրոֆորեզ՝ պոլիակրիլամիդ գելում (PAAG). SDS էլեկտրոֆորեզի մեթոդը ներառում է բնածին սպիտակուցների դենատուրացիա: Այսպիսով, նույն մոլեկուլային քաշ ունեցող սպիտակուցի մոլեկուլները գելի մեջ կանցնեն նույն ճանապարհով և կշարվեն ժապավենի տեսքով: Քանի որ խառնուրդում առկա են տարբեր չափերի սպիտակուցային մոլեկուլներ, ձևավորվում են բազմաթիվ շերտեր: Էլեկտրոֆորեզի արդյունքները կարելի է պատկերացնել սպիտակուցների ներկման միջոցով (Coomassie փայլուն կապույտ, ամիդո սև, արծաթագույն ներկում): Արծաթի ներկումն ունի յուրահատուկ զգայունություն, որը թույլ է տալիս ստացված շերտում հայտնաբերել ընդամենը 0,1 նգ սպիտակուց: Սա շատ կարևոր է գելի վրա կիրառվող սպիտակուցի քանակությունը վերահսկելու համար:

3) Սպիտակուցների տեղափոխում գելից թաղանթ. Դա արվում է, քանի որ պոլիակրիլամիդը թույլ չի տալիս իմունոգոլոբուլինի մեծ մոլեկուլները ցրվել դեպի սպիտակուց: Իսկ թաղանթի վրա անշարժացած սպիտակուցը հասանելի է դառնում հակամարմիններին։ Ի տարբերություն նուկլեինաթթվի բլթինգի, սպիտակուցի տեղափոխումը թաղանթ տեղի է ունենում էլեկտրական ուժերի ազդեցության տակ, այսինքն. էլեկտրական դաշտում.

4) Ստացված բլոտը ինկուբացվում է սպիտակուցային հակաշիճուկով, այնուհետև հակաիմունոգոլոբուլիններով: Արդյունքը ներկայացվում է ըստ օգտագործված պիտակի տեսակի:

Սահմանափակումներ:

1) ուսումնասիրված բեկորների մեծ չափերը, որոնք զգալիորեն գերազանցում են ԴՆԹ-ի զոնդերի երկարությունը և կանխում ուղղակի մոլեկուլային վերլուծությունը.

2) ուսումնասիրված հաջորդականությունների ծայրերի կամայական ընտրության անհնարինությունը, որը որոշվում է սկզբնական ԴՆԹ-ի մոլեկուլում համապատասխան սահմանափակման վայրերի առկայությամբ.

3) մեծ քանակությամբ լավ մաքրված բարձր մոլեկուլային գենոմային ԴՆԹ-ի անհրաժեշտությունը (առնվազն 10 մկգ մեկ ռեակցիայի համար, որը համարժեք է 0,5-1 մլ արյան),

4) գենոմային հիբրիդացման համար` ռադիոակտիվ ԴՆԹ-ի զոնդերի առկայություն` առնվազն 109 իմպուլս/րոպե * մկգ բարձր հատուկ ակտիվությամբ, որը գործում է սահմանափակ ժամանակով, և հատուկ սարքավորված իզոտոպային միավոր: Բացի այդ, ինքնագրերի երկար ցուցադրումը զգալիորեն երկարացնում է արդյունքների ստացման ժամանակը:

5) աշխատանքի բարձր ինտենսիվություն հետազոտություն

Ի՞նչ է Western Blotting-ը:

Սպիտակուցի նույնականացումը բարդ խառնուրդներում կամ տարբեր հյուսվածքների քաղվածքներում հաճախ հանդիպող խնդիրներից է: Օգտագործելով այնպիսի գործիք, ինչպիսին է հատուկ հակամարմինները, հնարավոր է որոշել ուսումնասիրվող սպիտակուցը նվազագույն ժամանակով և ֆինանսական ծախսերով:

Western blotting մեթոդով առաջին փուլում սպիտակուցների խառնուրդն անջատվում է էլեկտրոֆորեզով՝ նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատի (SDS) առկայությամբ, այնուհետև էլեկտրաբլոտման միջոցով տեղափոխվում է նիտրոցելյուլոզային թաղանթ։ Այս մեթոդի էությունը կայանում է նրանում, որ էլեկտրոֆորեզից հետո գելը տեղադրվում է նիտրոցելյուլոզային թաղանթի վրա ֆիլտրի թղթի շերտերի միջև: Այս կերպ հավաքված «սենդվիչը» տեղադրվում է էլեկտրական դաշտում, որպեսզի սպիտակուց-SDS կոմպլեքսները շարժվեն գելային թիթեղով և անշարժանան (ոչ սպեցիֆիկ սորբցիայի արդյունքում) նիտրոցելյուլոզային թաղանթի մակերեսին։

Սպիտակուց-SDS համալիրի նիտրոցելյուլոզային թաղանթին կապելու մեջ հիմնականում էլեկտրական ուժեր են ներգրավված, և այդ փոխազդեցությունը բազմակետ է և հանգեցնում է մեմբրանի մակերեսի վրա սպիտակուցների «տարածմանը»։ Այսպիսով, էլեկտրափոխանցումից հետո մենք ստանում ենք գելի կրկնօրինակը նիտրոցելյուլոզայի վրա՝ սպիտակուցներով, որոնք դասավորված են այնպես, ինչպես պոլիակրիլամիդ գելում:

SDS-ից հետո՝ էլեկտրոֆորեզից, գելից սպիտակուցների յուրացումից և նիտրոցելյուլոզային մեմբրանի վրա սպիտակուցի երրորդական կոնֆորմացիան մեծապես փոխվում է, եթե ընդհանուր առմամբ ճիշտ է խոսել սպիտակուցի երրորդական կառուցվածքի առկայության մասին նման կոշտ վերաբերմունքից հետո։ . Հետևաբար, ուսումնասիրվող սպիտակուցի իմունաքիմիական հայտնաբերման համար սովորաբար օգտագործվում են միայն մոնո- կամ պոլիկլոնալ հակամարմիններ, որոնք հատուկ են սպիտակուցի մոլեկուլի գծային շրջաններին: Կոնֆորմացիոն էպիտոպների համար հատուկ հակամարմինները (կամ միջենթախմբային կոնտակտներ պարունակող տեղամասերը) սովորաբար պիտանի չեն Western blot մեթոդով օգտագործելու համար:

Սպիտակուցի փոխանցումից հետո թաղանթը հաջորդաբար ինկուբացվում է ուսումնասիրվող սպիտակուցին հատուկ հակամարմիններով, այնուհետև առաջնային հակամարմինների Fc բեկորների համար հատուկ երկրորդական հակամարմիններով՝ կապված ֆերմենտի (կամ որևէ այլ) պիտակի հետ (նկ. 1 Ա): Այն դեպքում, երբ ուսումնասիրված անտիգենին հատուկ առաջնային հակամարմինները ուղղակիորեն կապված են պիտակի հետ, երկրորդական հակամարմիններ չեն պահանջվում (նկ. 1 Բ): Ուսումնասիրված սպիտակուցի տեղայնացման վայրում ձևավորված իմունային համալիրները «դրսևորվում են» քրոմոգեն սուբստրատի օգնությամբ (կախված պիտակի տեսակից):

Մեթոդի զգայունությունն ու յուրահատկությունը մեծապես կախված են նրանից, թե որ հակամարմիններն են օգտագործվում հետազոտության մեջ: Օգտագործված հակամարմինները պետք է հատուկ լինեն ամինաթթուների եզակի հաջորդականությանը, որը հատուկ է միայն ուսումնասիրվող սպիտակուցին: Հակառակ դեպքում հնարավոր է հակամարմինների փոխազդեցությունը (հատկապես կոպիտ սպիտակուցային քաղվածքների դեպքում) մի քանի սպիտակուցային մոլեկուլների հետ, ինչն իր հերթին կհանգեցնի թաղանթի վրա մի քանի գունավոր շերտերի առաջացմանը։ Այս դեպքում ուսումնասիրվող սպիտակուցի նույնականացումը հաճախ դժվար կամ նույնիսկ անհնար է:

Երկրորդ կարևոր գործոնը, որը պետք է հիշել հակամարմիններ ընտրելիս, մերձավորությունն է: Որքան բարձր է օգտագործվող հակամարմինների մերձեցումը, այնքան ավելի վառ և պարզ է սպիտակուցային շերտերի ներկումը, այնքան բարձր է մեթոդի զգայունությունը: Բարձր մերձեցման հակամարմիններ օգտագործելիս կարելի է հասնել 1 նգ և նույնիսկ ավելի բարձր զգայունության:

Մեմբրանի հետ կապված անտիգենի և հակամարմինների փոխազդեցության արդյունքը պատկերացնելու համար օգտագործվում են երկրորդական հակամարմիններ, որոնք զուգակցված են որոշակի պայմաններում որոշակի ազդանշան տալու ունակ գործակալների հետ: Սովորաբար որպես այդպիսի նյութ օգտագործվում է ֆերմենտ (պերօքսիդազ կամ ֆոսֆատազ), որի ռեակցիայի արտադրանքը գույն ունի և նստում է թաղանթի վրա՝ չլուծվող նստվածքի տեսքով։ Այս մեթոդով հնարավոր է նաև օգտագործել լյումինեսցենտային պիտակներ:

Բրինձ. 1. Ուսումնասիրված սպիտակուցի իմունաքիմիական ներկման սխեման. B - առաջնային հակամարմինը ուղղակիորեն կապված է ֆերմենտային պիտակի հետ:

Արձանագրություն:

I. Գելի և թաղանթի պատրաստում և սպիտակուցի էլեկտրատրանսֆեր

Էլեկտրաֆորեզից հետո պոլիակրիլամիդային գելը տեղադրվել է բլոտային բուֆերով լոգանքի մեջ (25 մՄ Տրիս, pH 8.3, 192 մՄ գլիցին, 10% էթանոլ): Զտիչ թղթի երկու թերթ՝ կտրված բլոտային կասետի ձևով և թրջված բլոտային բուֆերով, դրվում են կասետի այն մասի վրա, որը կդիմի անոդին: Այնուհետև ֆիլտրի թղթի վրա դրվում է նույն բուֆերով նախապես թրջված նիտրոցելյուլոզային թաղանթ՝ համոզվելով, որ թաղանթի և թղթի միջև օդային պղպջակներ չլինեն։ Դրանից հետո գելը պետք է խնամքով դնել թաղանթի վրա՝ կրկին հատուկ ուշադրություն դարձնելով գելի և թաղանթի միջև օդային փուչիկների բացակայությանը։ Սենդվիչն ամբողջացնում են թրջված ֆիլտր թղթի երկու շերտը, որոնք դրվում են գելի մակերեսին (նկ. 2): Ստացված սենդվիչը սեղմվում է ձայներիզում և տեղադրվում էլեկտրոդների միջև այնպես, որ թաղանթն ուղղված է անոդին:

Բրինձ. 2. Սպիտակուցների թաղանթին էլեկտրափոխանցման սխեմա.

II. էլեկտրափոխանցում

Սպիտակուցների էլեկտրափոխանցումը նիտրոցելյուլոզային թաղանթին իրականացվում է բուֆերում, որը պարունակում է 25 մՄ տրիս, pH 8,3, 192 մՄ գլիցին, 10% էթանոլ 30–50 րոպե 100 Վ հաստատուն լարման դեպքում: Էլեկտրափոխանցման ժամանակը կախված է չափից: փոխանցված սպիտակուցները, որքան մեծ է սպիտակուցը, այնքան երկար է տևում փոխանցումը: Էլեկտրատրանսպորտի որակը և սպիտակուցային շերտերի դասավորությունը գնահատվել է նիտրոցելյուլոզային թաղանթը ներկելով 0,3% Ponceau S-ով 1% քացախաթթուով: Նախքան իմունային ներկելը, թաղանթը պետք է մի քանի անգամ լվանալ մեղմ ալկալային տրիս ջրային լուծույթով՝ սպիտակուցներով կապված ներկը հեռացնելու համար:

III. Նիտրոցելյուլոզային թաղանթի վրա անշարժացած սպիտակուցների իմունաքիմիական ներկում

Ոչ սպեցիֆիկ հակամարմինների կապակցման վայրերը արգելափակելու համար թաղանթը 30 րոպե մշտական խառնելով սենյակային ջերմաստիճանում ինկուբացվում է PBST-ում (ավելի լավ արգելափակման համար կարող է օգտագործվել 10% յուղազերծված կաթի փոշի պարունակող PBST լուծույթ): Արգելափակումից հետո թաղանթը 1-10 մկգ/մլ հատուկ հակամարմիններ պարունակող PBST-ում անընդհատ խառնելով մեկ ժամ ինկուբացնում են սենյակային ջերմաստիճանում: Հակամարմինների օպտիմալ կոնցենտրացիան ընտրվում է էմպիրիկ եղանակով և կախված է հակամարմինների փոխազդեցությունից անտիգենի հետ: Ինկուբացիայի վերջում թաղանթը 5 անգամ լվացվել է PBST-ով և տեղափոխվել երկրորդական հակամարմինների լուծույթ՝ կապված ծովաբողկի պերօքսիդազի հետ: Կոնյուգատի նոսրացումը սովորաբար նշվում է արտադրողի կողմից փաթեթավորման վրա կամ ընտրվում է էմպիրիկ եղանակով հետազոտողի կողմից: Մեմբրանը 1 ժամ ինկուբացնում ենք երկրորդական հակամարմինների լուծույթում՝ անընդհատ խառնելով։

Մանրակրկիտ լվացումից հետո (առնվազն 5-6 բուֆերային փոփոխություն) PBST թաղանթը տեղափոխվում է քրոմոգեն ենթաշերտի լուծույթ, որը պարունակում է 3 մգ դիամինոբենզիդին (DAB) և 10 մկլ 30% ջրածնի պերօքսիդ 10 մլ 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6: . Ինկուբացիան իրականացվում է 5-ից 10 րոպե խառնելով: Ենթաշերտի հետ ինկուբացիայի ավարտից հետո թաղանթը պետք է լվանալ PBST-ով, չորացնել ֆիլտրի թղթով մաքրելով և անմիջապես պատրաստել էլեկտրոնային պատճեն՝ գունավոր սկանավորելով: Եթե թաղանթը ամբողջությամբ չորանում է, ներկված սպիտակուցի շերտերը գունաթափվում են, և պատկերն ավելի քիչ պայծառ ու հակապատկեր է դառնում:

Նշում. DAB-ը թունավոր է և պոտենցիալ քաղցկեղածին: Աշխատեք միայն ռետինե ձեռնոցներով:

Western blotting-ի օգտագործումը պարզել սպիտակուցները, որոնք բաժանվել են չափի հիման վրա գելային էլեկտրոֆորեզով: Իմունային վերլուծության ժամանակ օգտագործվում է նիտրոցելյուլոզից կամ PVDF-ից (պոլիվինիլիդեն ֆտորիդ) պատրաստված թաղանթ: Գելը տեղադրվում է թաղանթի կողքին և էլեկտրական հոսանքի կիրառումը դրդում է սպիտակուցներին գելից թաղանթ տեղափոխել: Այնուհետև թաղանթը կարող է հետագայում մշակվել հատուկ հակամարմիններով, որոնք նախատեսված են հետաքրքրության թիրախի համար, և տեսանելի լինել՝ օգտագործելով երկրորդական հակամարմիններ և հայտնաբերման ռեակտիվներ:

Դիտեք մեր Western blot արձանագրության տեսանյութը ստորև:

Լուծումներ և ռեակտիվներ՝ լիզի բուֆերներ

Այս բուֆերները կարող են պահվել 4°C ջերմաստիճանում մի քանի շաբաթ կամ բաժանել և պահել -20°C-ում մինչև մեկ տարի:

NP-40 բուֆեր

150 մՄ NaCl
1.0% NP-40 (հնարավոր է փոխարինել 0.1% Triton X-100-ով)
50 mM Tris-HCl, pH 8.0
Պրոթեզերոնի ինհիբիտորներ

RIPA բուֆեր (ռադիոիմունային նստվածքների փորձարկման բուֆեր)

150 մՄ NaCl
1.0% NP-40 կամ 0.1% Triton X-100
0,5% նատրիումի դեզօքսիքոլատ
0.1% SDS
50 mM Tris-HCl, pH 8.0
Պրոթեզերոնի ինհիբիտորներ

Տրիս-HCl

20 մՄ տրիս-HCl
Պրոթեզերոնի ինհիբիտորներ

Լուծումներ և ռեագենտներ. գործարկվող, փոխանցող և արգելափակող բուֆերներ

4% SDS
10% 2-mercaptoethanol
20% գլիկոլ
0.004% բրոմֆենոլ կապույտ
0,125 Մ Տրիս-HCl

Ստուգեք pH-ը և հարմարեցրեք 6.8-ի

Գործող բուֆեր (Tris-Glycine/SDS)

25 մմ Trisbase
190 մմ գլիցին
0.1% SDS

Փոխանցման բուֆեր (թաց)

25 մմ Trisbase
190 մմ գլիցին
20% մեթանոլ
Ստուգեք pH-ը և հարմարեցրեք 8.3-ի

80 կԴա-ից մեծ սպիտակուցների համար խորհուրդ ենք տալիս SDS-ը ներառել 0,1% վերջնական կոնցենտրացիայի դեպքում:

Փոխանցման բուֆեր (կիսաչոր)

48 մմ տրիս
39 մմ գլիցին
20% մեթանոլ
0.04% SDS

Արգելափակող բուֆեր

3–5% կաթ կամ BSA (խոզի շիճուկի ալբումին)

Ավելացնել TBST բուֆերին: Լավ խառնել և զտել։ Զտման ձախողումը կարող է հանգեցնել բծերի, որտեղ մանր մուգ հատիկները կաղտոտեն բիծը գույնի զարգացման ընթացքում:

Նմուշի լիզս

Բջջային կուլտուրայից լիզատի պատրաստում

Բջջային կուլտուրայի ամանը դրեք սառույցի վրա և լվացեք բջիջները սառցե PBS-ով:
Շնչեք PBS-ը, այնուհետև ավելացրեք սառույցով լիզի բուֆեր (1 մլ 107 բջիջի/100 մմ ափսեի/150 սմ2 կոլբայի համար; 0,5 մլ յուրաքանչյուր 5x10 6 բջիջի համար/60 մմ աման/75 սմ 2 կոլբայի համար):
Մաքրեք կպչուն բջիջները ամանից՝ օգտագործելով սառը պլաստմասե բջիջների քերիչ, ապա նրբորեն տեղափոխեք բջջային կախոցը նախապես սառեցված միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ: Որպես այլընտրանք, բջիջները կարող են տրիպսինիզացվել և լվանալ PBS-ով, նախքան միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ լիզի բուֆերի մեջ նորից լուծարելը:
Պահպանեք մշտական հուզում 30 րոպե 4°C-ում:
Ցենտրիֆուգեք միկրոցենտրիֆուգայում 4°C-ում: Հնարավոր է՝ ստիպված լինեք փոփոխել ցենտրիֆուգման ուժը և ժամանակը՝ կախված բջջի տեսակից. ուղեցույցը 20 րոպե է 12000 պտ/րոպում, բայց դա պետք է որոշվի ձեր փորձի համար (լեյկոցիտները շատ թեթև ցենտրիֆուգման կարիք ունեն):
Նրբորեն հեռացրեք խողովակները ցենտրիֆուգից և դրեք սառույցի վրա, ներծծեք վերին հեղուկը և դրեք սառույցի վրա պահվող թարմ խողովակի մեջ և դեն նետեք գնդիկը:

Հյուսվածքներից լիզատի պատրաստում

Հատեք հետաքրքրող հյուսվածքը մաքուր գործիքներով, նախընտրելի է սառույցի վրա և որքան հնարավոր է շուտ՝ պրոթեզերոնի դեգրադացիան կանխելու համար:
Հյուսվածքը տեղադրեք կլոր հատակով միկրոցենտրիֆուգային խողովակների կամ Էպենդորֆյան խողովակների մեջ և ընկղմեք հեղուկ ազոտի մեջ, որպեսզի հանկարծ սառչի: Նմուշները պահեք -80°C-ում՝ հետագայում օգտագործելու համար կամ պահեք սառույցի վրա՝ անհապաղ համասեռացման համար: ~5 մգ հյուսվածքի համար խողովակին արագորեն ավելացրեք ~300 մկլ սառցե լուծիչ բուֆեր, միաձուլեք էլեկտրական հոմոգենիզատորով, երկու անգամ ողողեք սայրը ևս 2 x 200 μL լիզի բուֆերով, այնուհետև 2 ժամ շարունակեք անընդհատ խառնել: 4°C (օրինակ՝ դրեք սառնարանում ուղեծրային շեյքերի վրա): Լիզի բուֆերի ծավալները պետք է որոշվեն առկա հյուսվածքի քանակի համեմատ. սպիտակուցի էքստրակտը չպետք է չափազանց նոսր լինի, որպեսզի խուսափի սպիտակուցի կորստից և մեծ քանակությամբ նմուշներ գելերի վրա լցնելու համար: Նվազագույն կոնցենտրացիան 0,1 մգ/մլ է, օպտիմալ կոնցենտրացիան՝ 1–5 մգ/մլ։
Ցենտրիֆուգեք 20 րոպե 12000 պտ/րոպում 4°C-ում միկրոցենտրիֆուգում: Մեղմորեն հեռացրեք խողովակները ցենտրիֆուգից և դրեք սառույցի վրա, ներծծեք վերին հեղուկը և դրեք սառույցի վրա պահվող թարմ խողովակի մեջ; դեն նետել գնդիկը:

նմուշի պատրաստում

Հեռացրեք լիզատի փոքր ծավալը՝ սպիտակուցների քանակական վերլուծություն կատարելու համար: Որոշեք սպիտակուցի կոնցենտրացիան յուրաքանչյուր բջիջի լիզատի համար:
Որոշեք, թե որքան սպիտակուց պետք է բեռնել և ավելացնել հավասար ծավալ 2X Laemmli նմուշի բուֆեր
Մենք խորհուրդ ենք տալիս կրճատել և դենատուրացնել նմուշները՝ օգտագործելով հետևյալ մեթոդը, բացառությամբ այն դեպքերի, երբ առցանց հակամարմինների տվյալների թերթիկը ցույց չի տալիս, որ պետք է օգտագործվեն չվերականգնող և չդենատուրացնող պայմաններ:
Նմուշները նվազեցնելու և դենատուրացնելու համար յուրաքանչյուր բջիջի լիզատ եփեք նմուշի բուֆերի մեջ 100°C ջերմաստիճանում 5 րոպե: Լիզատները կարող են մասնատվել և պահվել -20°C ջերմաստիճանում՝ հետագա օգտագործման համար:

Ներբեռնեք հավասար քանակությամբ սպիտակուցներ SDS-PAGE գելի հորերի մեջ՝ մոլեկուլային քաշի մարկերի հետ միասին: Բեռնել 20–30 մկգ ընդհանուր սպիտակուցը բջիջների լիզատից կամ հյուսվածքների միատարրից կամ 10–100 նգ մաքրված սպիտակուց։
Օգտագործեք գելը 1-2 ժամ 100 Վ-ում:

Տ ժամանակը և լարումը կարող են օպտիմալացում պահանջել: Խորհուրդ ենք տալիս հետևել արտադրողի հրահանգներին: Պետք է օգտագործվի նվազեցնող գել, բացառությամբ այն դեպքերի, երբ հակամարմինների տվյալների թերթիկում առաջարկվում են չնվազեցնող պայմաններ:

Պահանջվող գելի տոկոսը կախված է ձեր հետաքրքրող սպիտակուցի չափից.

սպիտակուցի չափը	Գելի տոկոս

Կարող են օգտագործվել նաև գրադիենտ գելեր։

Սպիտակուցի տեղափոխում գելից թաղանթ

Մեմբրանը կարող է լինել կամ նիտրոցելյուլոզ կամ PVDF: Ակտիվացրեք PVDF-ը մեթանոլով 1 րոպե և լվացեք փոխանցման բուֆերով՝ նախքան կույտը պատրաստելը: Փոխանցման ժամանակը և լարումը կարող են որոշակի օպտիմալացում պահանջել: Խորհուրդ ենք տալիս հետևել արտադրողի հրահանգներին: Սպիտակուցների տեղափոխումը թաղանթին կարելի է ստուգել՝ օգտագործելով Ponceau S ներկումը մինչև արգելափակման քայլը:

Պատրաստեք կույտը հետևյալ կերպ.

Նկար 1. Պատրաստված կույտի օրինակ:

Հակամարմինների ներկում

Արգելափակեք թաղանթը 1 ժամով սենյակային ջերմաստիճանում կամ գիշերը 4°C-ում՝ արգելափակող բուֆերի միջոցով:
Ինկուբացնել մեմբրանը արգելափակող բուֆերի մեջ առաջնային հակամարմինների համապատասխան նոսրացումներով: Խորհուրդ ենք տալիս գիշերային ինկուբացիա 4°C ջերմաստիճանում; այլ պայմաններ կարող են օպտիմիզացվել:
Ինկուբացնել թաղանթը խոնարհված երկրորդական հակամարմինների առաջարկվող նոսրացումով արգելափակող բուֆերում սենյակային ջերմաստիճանում 1 ժամ:
Լվացեք թաղանթը TBST-ով երեք լվացումով՝ յուրաքանչյուրը 5 րոպե:
Ազդանշանի մշակման համար հետևեք հանդերձանքի արտադրողի առաջարկություններին: Հեռացրեք ավելցուկային ռեակտիվը և ծածկեք թաղանթը թափանցիկ պլաստիկ թաղանթով:
Ձեռք բերեք պատկեր՝ օգտագործելով մութ սենյակի մշակման տեխնիկան քիմիլյումինեսցենտության համար կամ սովորական պատկերի սկանավորման մեթոդներ՝ գունաչափական հայտնաբերման համար:

Օգտակար հղումներ

Բոլոր ուղիները. բետա ակտին հակամարմին - բեռնման հսկողություն (ab8227) 1/5000 նոսրացումով

Շրջանակ 1. HeLa ամբողջ բջիջների քաղվածք
Երթուղի 2. Խմորիչի բջիջների քաղվածք
3-րդ գիծ. մկնիկի ուղեղի հյուսվածքի լիզատ

Դիտեք մեր հասանելի դրական հսկողության լիզատների, արգելափակող պեպտիդների և դրական վերահսկողության սպիտակուցների մեր ցուցակը:
Դիտեք բացառիկ վեսթերն բլոտների համար:

Արձանագրությունները տրամադրվում են Abcam «AS-IS»-ի կողմից՝ հիմնված Abcam-ի լաբորատորիաներում կատարվող փորձերի վրա՝ օգտագործելով Abcam-ի ռեակտիվները և արտադրանքները. Այս պայմաններից դուրս արձանագրությունների օգտագործման արդյունքները կարող են տարբեր լինել:

Վեբինարի սղագրություն

Western blotting-ի նպատակը գելի վրա սպիտակուցների առանձնացումն է՝ ըստ մոլեկուլային քաշի: Այնուհետև սպիտակուցները տեղափոխվում են թաղանթ, որտեղ դրանք կարող են հայտնաբերվել հակամարմինների միջոցով: Տաքացրեք նմուշները և 95 աստիճան C ջերմաստիճանում հինգից 10 րոպե բուֆերային նմուշում, որը պարունակում է վերականգնող նյութ, ինչպիսին է բետա-մերկապտոէթանոլը: Սա հանգեցնում է գծային սպիտակուցների՝ իրենց չափերին համաչափ բացասական լիցքով:

Տեղադրեք գելը էլեկտրոֆորեզի բաքի մեջ և տեղադրեք բուֆերի մեջ՝ ապահովելով հորերի վերին մասը ծածկված: Օգտագործվող գելի ակրիլամիդի տոկոսը կախված է թիրախային սպիտակուցի մոլեկուլային քաշից: Միացրեք մոլեկուլային քաշի շուկան առաջին գծի մեջ, այնուհետև բեռնեք նմուշները հարակից հորեր: Բոլոր նմուշները, որոնք պարունակում էին հավասար քանակությամբ սպիտակուցներ: Բոլոր նմուշները բեռնվելուց հետո, գովազդային բուֆերը տեղադրեք կափարիչը էլեկտրոֆորեզի բաքի վրա: Միացրեք էլեկտրամատակարարումը և սահմանեք գելերի արտադրողի կողմից առաջարկվող լարումը գել տանկի մեջ: Դուք պետք է կարողանաք տեսնել տանկի միջով բարձրացող փուչիկները: Գործարկեք գելը այնքան ժամանակ, մինչև մատրակի ճակատը բավականաչափ շարժվի գելի վրա:

Հաջորդ փուլը գելից սպիտակուցները մեմբրանի վրա տեղափոխելն է: Մեմբրանները սովորաբար պատրաստվում են նիտրոցելյուլոզից կամ PVDF-ից: Հեռացրեք գելը տանկից և զգուշորեն ազատեք այն իր պլաստիկ պատյանից: Կտրեք հորերը և գելի ոտքը և գելը տեղադրեք փոխանցման բուֆերի մեջ: Պատրաստեք փոխանցման կույտը` թաղանթը և գելը դնելով ֆիլտրի թղթի և սպունգի միջև: Մեմբրանը պետք է հետևել դրական էլեկտրոդին, իսկ գելը՝ բացասական էլեկտրոդին ամենամոտ: Գելի և թաղանթի միջև եղած փուչիկները հեռացնելու համար օգտագործեք փոքրիկ գլան: Կափարիչը փակեք փոխանցման տուփը և ընկղմեք փոխանցման բաքի մեջ, որը պարունակում է փոխանցման բուֆեր: Համակարգը սառը պահելու համար ջուր ավելացրեք արտաքին խցիկի մեջ և դրեք կափարիչը: Միացրեք էլեկտրամատակարարումը, որպեսզի սկսեք սպիտակուցի փոխանցումը: Ժամանակը և լարումը պահանջում են օպտիմալացում, այնպես որ ստուգեք արտադրողի հրահանգները ուղեցույցի համար:

Այժմ, երբ սպիտակուցները գաղթել են գելից դեպի նիտրոցելյուլոզային թաղանթ, հետաքրքրող սպիտակուցը կարող է հայտնաբերվել որպես հակամարմին: Մեմբրանը կարող է հանվել ձայներիզից, և մոլեկուլային քաշի շուկան այժմ պետք է տեսանելի լինի: Անհրաժեշտության դեպքում սպիտակուցների փոխանցումը կարող է հաստատվել՝ թաղանթը լուծույթով ներկելով: Հակամարմինների ոչ սպեցիֆիկ կապը կանխելու համար անհրաժեշտ է արգելափակել թաղանթը: Լցնել արգելափակող բուֆերը թաղանթի վրա և նրբորեն խառնել ռոքերի վրա: Սովորաբար դա արվում է հինգ տոկոս կաթի կամ տավարի շիճուկի ալբումինի (BSA) լուծույթի միջոցով երկու ժամ սենյակային ջերմաստիճանում կամ գիշերը չորս աստիճանով: Արգելափակման բուֆերի ժամանակը և տեսակը պետք է օպտիմիզացված լինեն, ուստի մանրամասների համար ստուգեք առաջնային հակամարմինի տվյալների թերթիկը, որը դուք մտադիր եք օգտագործել:

Մեմբրանի արգելափակումից հետո հեռացրեք արգելափակող բուֆերը և ավելացրեք նոսրացված առաջնային հակամարմինը նույն լուծույթում: Ինկուբացնել ռոքերի վրա, ինչպես նախկինում: Սովորաբար առաջնային հակամարմինների ինկուբացիաները կատարվում են մեկ ժամով սենյակային ջերմաստիճանում կամ գիշերը չորս աստիճան C ջերմաստիճանում: Հակամարմինների կոնցենտրացիան և ինկուբացիոն ժամանակը պետք է օպտիմալացվեն: Ուղեցույցի համար տես հակամարմինների տվյալների թերթիկը: Լցնել առաջնային հակամարմինը և թաղանթը երկու անգամ լվանալ լվացքի բուֆերի մեջ: Հետևեք մեկ 15 րոպեանոց և երեք 10 րոպեանոց լվացում ռոքերի վրա: Լվացքի բուֆերը սովորաբար Trys բուֆերացված ֆիզիոլոգիական լուծույթ է, TBS կամ ֆոսֆատով բուֆերացված, ֆիզիոլոգիական լուծույթ, PBS, 0,1 տոկոս tween 20-ով:

Լցնել լվացքի բուֆերը և ինկուբացնել թաղանթը զուգակցվող երկրորդական հակամարմինի մեջ, որը նոսրացվել է արգելափակող բուֆերի մեջ: Սովորաբար դա արվում է մեկ ժամ սենյակային ջերմաստիճանում, սակայն հակամարմինների կոնցենտրացիան և ինկուբացիոն ժամանակը պետք է օպտիմալացվեն: Հեռացրեք երկրորդական հակամարմինը և լվացեք նախկինում ցուցադրված թաղանթը:

Գոյություն ունեն հայտնաբերման մի քանի տարբեր համակարգեր: Եթե երկրորդական հակամարմինները զուգակցվում են ֆերմենտի մեջ, ապա պատկերազարդումից առաջ թաղանթը ինկուբացրեք համապատասխան սուբստրատի մեջ: Եթե երկրորդական հակամարմինները լյումինեսցենտային կոնյուգատներ են, ապա դուք կարող եք ուղղակիորեն անցնել պատկերավորման փուլին: Պատկերումը կարող է իրականացվել ռենտգեն ֆիլմով կամ թվային պատկերային համակարգով: Տեղադրեք թաղանթը պատկերային սկուտեղի մեջ: Տեղադրեք պատկերային սկուտեղը պատկերային համակարգում: Շփման ժամանակները, ամենայն հավանականությամբ, պետք է օպտիմիզացվեն, որպեսզի հստակ հայտնաբերվեն հետաքրքրող սպիտակուցների հետ կապված շերտերը:

Բլոտինգ(անգլերենից» բլոտ«- կետ) - ԼՂ-ի, սպիտակուցների և լիպիդների տեղափոխում պինդ սուբստրատի վրա, օրինակ՝ թաղանթ և դրանց անշարժացում։

Բլոտինգի մոլեկուլների տարանջատման մեթոդներ.

էլեկտրոֆորեզ պոլիակրիլամիդ գելում.

իզոէլեկտրական ֆոկուս - սպիտակուցներ առանձնացնել իզոէլեկտրական կետով (pI);
երկչափ (2D) էլեկտրոֆորեզ - սպիտակուցներն առանձնացնել երկու ուղղությամբ՝ ըստ իզոէլեկտրական կետի և մոլեկուլային քաշի.
ագարոզայի գել էլեկտրոֆորեզ - NC տարանջատում:

բարակ շերտով քրոմատոգրաֆիա - լիպիդների տարանջատում լիպիդային համալիրներից:

Փոխանցման մեթոդներ.

մոլեկուլների դիֆուզիոն - դանդաղ տրանսպորտ, որը հաճախ օգտագործվում է լիպիդների համար;
մազանոթ բլոտինգ - թաղանթը սեղմվում է գելի վրա, դրա վրա դրվում է ֆիլտրի թղթի բուրգ, փոխանցման բուֆերը խոնավացնում է գելը և բարձրանում մազանոթային ուժերի ազդեցությամբ՝ թրջելով ֆիլտրի թուղթը և մակրոմոլեկուլները գելից տեղափոխելով գել: թաղանթ; Մազանոթային բլոտինգը կարող է իրականացվել.

վակուումային բլոթինգ - նման է մազանոթային բլոտին, բայց փոխանցումն արագանում է ֆիլտրի թուղթը թրջելուց առաջացած մազանոթային ուժերի փոխարեն վակուումի օգտագործմամբ.
էլեկտրոբլոտինգ - լիցքավորված մակրոմոլեկուլների տեղափոխումը թաղանթ տեղի է ունենում էլեկտրական հոսանքի ազդեցության տակ.
ԼՂ-ի «կարում» մեմբրանի վրա ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման կամ տաքացման ազդեցության տակ - նեյլոնե թաղանթների վրա վերջնական ամրագրման համար.
dot blotting (slot blotting) - նմուշը կիրառվում է կետի կամ գծիկի տեսքով ուղղակիորեն թաղանթի վրա՝ առանց գելի կամ TLC ափսեի մոլեկուլների նախնական բաժանման:

Մեմբրանի տեսակները.

PVDF մեմբրաններ (պոլիվինիլիդեն ֆտորիդ);
NC մեմբրաններ (nitrocellulose);
նեյլոնե թաղանթներ (օգտագործվում են NDT-ի համար):

Մեմբրանի վրա մակրոմոլեկուլների պիտակավորման և հայտնաբերման մեթոդներ.

գունավորում - ներկերի կապում (արծաթի իոններ, Coomassie, Ponceau, ethidium bromide) ուղղակիորեն հայտնաբերելի մակրոմոլեկուլներով;
իմունաքիմիական պիտակավորում - մակրոմոլեկուլների պիտակավորումը տեղի է ունենում պիտակավորված հակամարմինների պատճառով, որոնք հատուկ կապում են դրանց, հայտնաբերումն իրականացվում է.

ճառագայթային պիտակավորում - ճառագայթային պիտակները (ռադիոիզոտոպներ) ներմուծվում են մակրոմոլեկուլների մեջ, հայտնաբերումն իրականացվում է օգտագործելով.

հիբրիդացում - նուկլեինաթթուների միացում պիտակավորված օլիգոնուկլեոտիդներով, կոմպլեմենտար կառուցվածքով, հայտնաբերումը, որպես կանոն, իրականացվում է պիտակի ճառագայթման կամ ֆլուորեսցենտության արտանետման գրանցմամբ.
զանգվածային սպեկտրոմետրիա - օգտագործվում է լիպիդների ուղղակի կառուցվածքային վերլուծության համար:

Բլոտինգի սորտերի ընդունված անվանումները.

Հարավային բլոտինգ(Southern blotting) - Էդվին Սաութերի անունով, ով առաջարկել է մեթոդ՝ որոշել ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը նմուշում և որոշել գենոմային ԴՆԹ-ում գեների կրկնօրինակների քանակը: Մեմբրանի տեղափոխմանը նախորդում է նմուշի մարսումը սահմանափակող էնդոնուկլեազներով բեկորների մեջ և դրանց մասնատումը ագարոզայի գելի մեջ էլեկտրոֆորեզով: Մեմբրանի վերլուծությունը կատարվում է հիբրիդացման միջոցով՝ հայտնի հաջորդականության պիտակավորված օլիգոնուկլեոտիդներով;
հյուսիսային բլոտինգ- Նմուշում ՌՆԹ-ի հաջորդականության որոշում և գենի արտահայտման ուսումնասիրություն (mRNA-ի որոշում): Նման է Հարավային բլոտինգին, սակայն նմուշից մեկուսացված ՌՆԹ մոլեկուլները հետազոտվում են առանց էնդոնուկլեազների ճեղքման: Մոլեկուլների բաժանումն իրականացվում է ագարոզայի գելում՝ ֆորմալդեհիդի ավելացումով (ՌՆԹ-ի դենատուրացիայի համար) կամ պոլիակրիլամիդ գելում՝ միզանյութի ավելացումով (օգտագործվում է միկրոՌՆԹ վերլուծության համար)։ Մեմբրանի վրա ՌՆԹ մոլեկուլների անշարժացումը տեղի է ունենում վակուումի տակ տաքացնելու կամ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման միջոցով «կարելու» պատճառով.
western blotting- սպիտակուցային իմունոբլոտինգ - վերլուծական մեթոդ, որն օգտագործվում է նմուշում հատուկ սպիտակուցներ որոշելու համար: Մեմբրանի տեղափոխմանը նախորդում է սպիտակուցների տարանջատումը պոլիակրիլամիդ գելի մեջ: Մեմբրանի վրա սպիտակուցների վերլուծությունը իրականացվում է իմունոքիմիական եղանակով.
հեռու Վեսթերն բլոտինգ- սպիտակուցային բլոթինգ, որն օգտագործվում է սպիտակուցի և սպիտակուցի փոխազդեցության որոշման համար, որը նման է Western blotting-ին, բայց հակամարմինների փոխարեն օգտագործվում են այլ սպիտակուցներ, որոնք հատուկ կապում են ուսումնասիրվող սպիտակուցին.
հարավ-արևմտյան բլոտինգԴՆԹ-ի մոլեկուլներում ԴՆԹ-ի հետ կապող սպիտակուցների և սպիտակուցների կապակցման վայրերի որոշում. նման է Western blotting-ին, սակայն պոլիակրիլամիդային գելային էլեկտրոֆորեզը դենատուրացնելուց հետո սպիտակուցները լվանում են նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատից միզանյութի առկայության դեպքում և տեղափոխվում նիտրոցելյուլոզային թաղանթ՝ դիֆուզիայի պատճառով: . Որպես նմուշ օգտագործվում են տարբեր երկարությունների ԴՆԹ-ի պիտակավորված բեկորներ, որոնք ստացվել են գենոմային ԴՆԹ-ի ավելի մեծ ուսումնասիրված բեկորի կտրվածքով: Այնուհետև կապված ԴՆԹ-ի մոլեկուլները լվանում են յուրաքանչյուր պրոտեին-ԴՆԹ համալիրից և վերլուծվում պոլիակրիլամիդ գելային էլեկտրոֆորեզի միջոցով;
Արևելյան բլոտինգ- սպիտակուցների հետթարգմանական փոփոխությունների որոշում (լիպիդներ, գլիկոպոլիսաքարիդներ, դրանց հետ կապված ֆոսֆատի մնացորդներ) - նման է Western blotting-ին, բայց հակամարմինները օգտագործվում են ոչ թե սպիտակուցների, այլ լիպիդների, գլիկոպոլիսաքարիդների և այլնի նկատմամբ: Բացի հակամարմիններից, որպես նմուշներ օգտագործվում են նաև այլ սպիտակուցային մոլեկուլներ, որոնք կապվում են ուսումնասիրվածներին (օրինակ՝ լեկտին);
Հեռավոր Արևելքի Բլոտինգ- բարձր արդյունավետության բարակ շերտով քրոմատոգրաֆիայի միջոցով առանձնացված լիպիդների վերլուծություն: Փոխանցումը թաղանթին, որպես կանոն, իրականացվում է դիֆուզիոն եղանակով։ Գրանցումն իրականացվում է ուղղակի զանգվածային սպեկտրաչափական կառուցվածքային վերլուծության միջոցով: